哺乳動物細胞組織培養技術指南。涵蓋大量關于哺乳動物細胞系的維持、分裂和細胞保存的信息。請注意，所有細胞培養必須使用無菌技術在層流罩中進行。

細胞培養是細胞和分子生物學中使用的關鍵工具，可以對細胞的生理學和生物化學進行建模。此外，細胞培養使研究人員能夠確定藥物和有毒化合物對細胞反應的影響。由于使用一批克隆細胞可獲得一致和可重復的結果，細胞培養仍然是當今研究中使用*泛的技術之一。

來自動物或植物的細胞在有利環境中的生長被稱為細胞培養。不同的細胞有不同的培養要求，為了達到最佳的生長效果，可以通過培養基的選擇和補充劑來滿足。所用介質的作用是提供必需的營養物質（氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質）、生長因子、激素、氣體（O2、 CO2），并調節物理化學環境（pH值、滲透壓、溫度）。

原代培養是指在組織分離后直接進行培養的細胞。一旦這些細胞匯合，即會占據燒瓶中所有可用空間，此時就需要將它們轉移到一個新的生長容器中進行傳代或分割，這將為細胞提供更多的繼續生長和擴展的空間。第一次傳代后，原代培養現在成為所謂的細胞系。源自原代培養的細胞系壽命有限，這意味著它們在衰老之前只能分裂有限的次數。

由于細胞被傳代，生長能力*的細胞占優勢，導致群體的基因型和表型一致。永生細胞系廣泛用于細胞和分子生物學，以繞過衰老等問題。細胞可以通過多種不同方式轉化并永生。自發地、化學地或病毒地。一旦轉化，這些細胞就獲得了無限分裂的能力，成為一個連續的細胞系。

細胞系可以是：

1.貼壁（貼壁依賴性）——貼壁細胞必須在附著于固體或半固體底物上時進行培養，通常需要胰蛋白酶法進行亞培養（更多信息請參見2.6）。

2.懸浮（與錨固無關）——懸浮細胞不需要固體生長底物，可以懸浮在培養基中生長。

以下是細胞系培養的通用指南。所有細胞培養必須在微生物安全柜中進行，使用無菌技術確保無菌。研究人員必須全程穿著防護服。

良好的無菌技術旨在創建無菌環境，并充當微生物與無菌細胞培養罩之間的屏障。該技術的關鍵包括使用無菌試劑和培養基。無菌操作確保未經過70%乙醇噴灑過的任何物體進入罩內。

層流罩制備

細胞培養罩可提供無菌工作區，同時可確保控制微生物程序產生的任何傳染性飛濺物或氣溶膠。細胞培養罩有3種類型，分別為I級、II級和III級，這些都是為了滿足不同的研究和生物安全需求而開發的。請根據實驗需求選擇合適的產品。

使用層流罩

在開始之前，確保針對感目標細胞系使用正確的培養基類型和培養補充劑。這些必須始終是無菌的，并且只能在罩內打開。大多數細胞系可以使用Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養基或含10％胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培養基。如果需要，可以添加2mM 谷氨酰胺和抗生素。

如何準備DMEM介質

某些內皮細胞系需要特殊的膠原蛋白基質才能生長。這些基質確保細胞系的附著、分化和生長。在開始細胞培養實驗之前，重要的是對目標胞系進行文獻調查，以確保滿足任何額外的生長要求，如基質。請注意所用燒瓶的類型，即通氣或不通氣。如果使用非通氣/塞瓶燒瓶，請確保松開蓋子以進行氣體交換。如果使用通氣燒瓶，請確保過濾器不會弄濕，因為這會影響氣體交換的效率。

如何為內皮和上皮細胞制備1％明膠基質

每天應在顯微鏡下檢查細胞，以確保它們健康并按預期生長。熟悉顯微鏡下健康細胞的外觀非常重要，因為這將使通過形態變化檢測靜止或感染的細胞更加容易。

如果出現以下情況，請丟棄細胞：

哺乳動物細胞匯合時應分裂/傳代，這在燒瓶中70-80％的面積被細胞覆蓋時發生。在貼壁細胞中，當沒有可見的空間可用于細胞生長時，可以在顯微鏡下觀察到匯合。對于懸浮細胞，當細胞凝聚在一起時，可以注意到匯合，并且當燒瓶旋轉時，培養基看起來會混濁。

重要的是，不要讓細胞過度匯合，以70-80％的匯合為最佳量，在這種情況下，接觸抑制作用開始生效，并且細胞在重新接種后需要更長的恢復時間。細胞系生長的速度將決定所使用的分裂比。例如，如果以高比例分裂，生長緩慢的細胞系將不能很好地發揮作用。

快速生長的細胞系可能需要較高的分裂比例，因為與生長較慢的細胞系相比，它們需要更短的時間達到匯合。通常，細胞分裂的比例不應超過1:10，因為這對于細胞而言太低，將是細胞無法生存。改變培養物的接種密度可確保細胞在特定的一天準備好進行實驗。

作為通用指南，一個匯合燒瓶中的細胞：70-80％的匯合分裂比例應為1：2，并準備在1-2天進行實驗。70-80％的匯合分裂比例應為1：5，并準備在2-4天進行實驗。70-80％的匯合分裂比例應為1：10，并準備在4-6天進行亞培養或電鍍。但這可能取決于細胞系的生長速率。

* 胰蛋白酶消化可能對有些細胞有毒。它還可以誘導某些膜蛋白的暫時內在化，在設計實驗時應予以考慮。在這些情況下，通常可以使用其他方法（例如溫和的細胞刮擦或使用清潔劑）代替。

如果細胞已經生長了幾天，但匯合程度不足以分裂，則必須更換介質以補充營養并保持pH值。

對于貼壁細胞

對于懸浮細胞

傳代數是細胞經歷的傳代培養的次數。應記錄傳代數并且傳代數不應太高。與低傳代細胞相比，傳代數大于30的細胞系更有可能獲得遺傳異常（Esquenet et al., 1997; Lin et al., 2003; O’Driscoll et al., 2006）。

P30通常被認為是培養中某些細胞傳代的上限，因為進一步培養可能會導致分子譜的顯著變化，限制其在體內的應用和可重復性（Calles et al., 2006; O’Driscoll et al., 2006; Wenger et al., 2004）。

冷凍細胞系是細胞培養的重要組成部分，因為更換細胞系既昂貴又費時，而且還可以確保如果細胞被感染，還將擁有備用庫存并可以重新開始。一旦有多余的細胞可用，最好是低傳代數以限制遺傳漂變，就應將其冷凍為接種庫存。然后可以從接種庫存中準備使用的細胞。

冷凍保存細胞的最佳和*泛使用的方法是將它們保存在帶有冷凍保護劑，例如二甲基亞砜（DMSO）的液氮中。冷凍保護劑（例如DMSO）降低了培養基的凝固點并降低了冷卻速度，從而大大降低了冰晶形成的風險，而該冰晶會導致細胞死亡和損壞。配置細胞凍存液需要培養基，血清和DMSO，按照一定比例配置。費事費時費力。靶點科技有現成直接使用的Bambanker無血清細胞凍存液（貨號BB01），可以直接放到-80，無需梯度程序降溫。

冷凍細胞方案

*以盡可能高的濃度和盡可能低的傳代數冷凍培養的細胞。冷凍之前，請確保至少有90％的細胞能夠存活。始終使用無菌冷凍管保存冷凍細胞。始終使用適當的無菌技術，并在層流罩中工作。

安全注意事項：使用DMSO時應格外小心，因其會促進有機分子進入組織。處理該試劑時，請戴手套并穿著適當的防護服。按照當地法規處理試劑。

解凍細胞對冷凍細胞的壓力*，因此與冷凍細胞應緩慢進行冷凍不同，解凍細胞應盡可能快地進行，以確保細胞的高存活率。

解凍細胞方案

細胞培養實驗室中最常見的污染物之一是支原體。支原體是一種缺乏細胞壁的基本細菌，被認為是最小的自我復制生物。由于支原體的尺寸很小（大約> 1µm），因此很難檢測到，直到達到*的密度并導致細胞培養物變質才會知道它們的存在。

許多生長緩慢的支原體可以在未檢測到的培養物中持續存在而不會引起細胞死亡，但是，它們可以改變培養物中宿主細胞的行為和代謝。慢性支原體感染也可能導致懸浮培養物中細胞增殖速率降低，飽和密度降低和凝集。檢測此類支原體感染的方法是定期檢測細胞培養物；熒光染色（例如Hoechst）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測定。

應謹慎使用細胞培養中的抗生素。連續使用抗生素會增強抗生素耐藥性，允許存在低水平的污染并掩蓋各種污染物。一些抗生素還可以與細胞發生交叉反應并干擾正在研究的細胞過程。

細胞培養實驗室根據研究機構和研究領域的不同而有很大差異。但是，所有細胞培養實驗室確實都具有一些的通用設備和要求，其中最重要的是保持無菌的病原體環境。以下是可在更多細胞培養實驗室中使用的常見設備和材料的列表。此列表并不完整，根據研究領域的不同可見其中的偏差。

基本設備

細胞培養實驗室根據研究機構和研究領域的不同而有很大差異。但是，所有細胞培養實驗室確實都具有一些的通用設備和要求，其中最重要的是保持無菌的病原體環境。以下是可在更多細胞培養實驗室中使用的常見設備和材料的列表。此列表并不完整，根據研究領域的不同可見其中的偏差。

• 細胞培養罩（即層流罩或生物安全柜）
• 保溫箱（建議使用潮濕的CO2保溫箱）
• 水浴
• 離心機
• 冰箱和冰柜（–20℃）
• 細胞計數器（自動細胞計數器或血細胞計數器）
• 倒置顯微鏡
• 液氮（N2）冰箱或冷凍儲藏容器
• 細胞培養容器（例如燒瓶、培養皿、滾瓶、多孔板）
• 移液器
• 注射器和針頭
• 垃圾箱
• 培養基、血清和試劑
• 細胞