活細胞超分辨顯微技術可實現衍射極限以下生物結構動態過程的成像。本文提出增強型超分辨徑向漲落算法（eSRRF），相較原始 SRRF 方法，該算法能夠大幅提升圖像保真度與分辨率。eSRRF 內置基于圖像數據的自動化參數優化流程，可直觀反映分辨率與圖像保真度二者間的權衡關系。
我們在多種成像模態與生物體系中驗證了 eSRRF 算法的成像效果。值得一提的是，通過與多焦點顯微技術聯用，我們將 eSRRF 拓展至三維成像維度，實現了每秒約一套三維立體圖像采集速度的活細胞體層超分辨成像。
eSRRF 是一種易上手的超分辨成像方案，可在各類實驗條件下提取有效成像信息，同時抑制成像偽影。該算法的參數預測策略具備通用性，有助于推動超分辨顯微成像領域實現無偏數據分析。
所有實驗操作均遵循歐洲動物保護與使用委員會頒布的實驗動物準則（86/609/CEE），并獲得艾克斯 - 馬賽大學倫理委員會審批（審批編號：G13O555）。實驗所用原代神經元取自妊娠雌性威斯塔大鼠（Janvier Labs）孕 18 天（E18）雌雄胎鼠的海馬組織。解剖分離海馬組織，經胰酶消化后機械吹打制成細胞懸液，接種于直徑 18 mm、1.5H 號圓形蓋玻片，接種密度 30000 個細胞 / 平方厘米；細胞先在含血清鋪板培養基中孵育 3 小時，鋪板培養基配方為：基礎低必需培養基（MEM）添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.6% 葡萄糖、0.08 mg/mL 丙酮酸鈉、100 單位 / 毫升青鏈霉素混合液。隨后將蓋玻片細胞面向下轉移至鋪有長滿膠質細胞的培養皿中，膠質細胞預先使用 NB + 培養基條件化處理；NB + 培養基成分為：神經基礎培養基（Neurobasal）添加 2% B27 添加劑、100 單位 / 毫升青鏈霉素、2.5 μg/mL 兩性霉素 B，采用 Banker 法完成神經元共培養。
細胞培養至第 6–9 天，使用脂質轉染試劑 Lipofectamine（2 μL，賽默飛）對神經元進行轉染，轉染質粒選用以下兩種之一：1 μg pEGFP–α- 微管蛋白質粒（Clontech，貨號 632349）或 pSkylan-NS–α- 微管蛋白質粒。pSkylan-NS–α- 微管蛋白質粒通過吉布森組裝法??構建：以 mScarlet–α- 微管蛋白質粒（Addgene 質粒編號 #8504574）為骨架，將其中 mScarlet 熒光蛋白序列替換為 Skylan-NS 序列（Addgene 質粒編號 #8678558）；組裝體系混合酶體系包含：0.005 單位 / 微升 T5 核酸外切酶（NEB，貨號 M0663S）、0.033 單位 / 微升 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（Finnzymes，貨號 F-553L）、5.33 單位 / 微升 Taq DNA 連接酶（NZYTEch，貨號 MB42601）。轉染 24–48 小時后開展活細胞成像實驗。成像前將神經元換為 E 型休眠培養基（Brainbits），培養基添加 2% B27、2 mM 谷氨酰胺補充劑（Glutamax）與 0.4% D - 葡萄糖；整套成像過程中細胞置于恒溫濕控載物臺培養系統（Okolab），36℃恒溫維持細胞活性。
All procedures were in agreement with the guidelines established by the European Animal Care and Use Committee (86/609/CEE) and were approved by the Aix-Marseille University ethics committee (agreement no. G13O555). Primary neuronal cell culture was produced by extracting hippocampi from E18 rat pups of both sexes from pregnant female Wistar rats (Janvier Labs). Hippocampi were dissected and homogenized by trypsin treatment followed by mechanical trituration and seeded on 18-mm diameter, round, no. 1.5H coverslips at a density of 30,000?cells?cm?2 for 3?h in serum-containing plating medium (MEM with 10% FBS, 0.6% added glucose, 0.08?mg?ml?1 sodium pyruvate and 100?UI?ml?1 penstrep). Coverslips were then transferred, cells down, to Petri dishes containing confluent glia cultures conditioned in NB+ medium (neurobasal medium supplemented with 2% B27, 100?UI?ml?1 penstrep and 2.5?µg?ml?1 amphotericin) and cultured in these dishes (Banker method).
Neurons were transfected with either 1?μg pEGFP–α-tubulin (Clontech cat. no. 632349) or pSkylan-NS–α-tubulin at 6–9?d in culture with Lipofectamine (2?µl, Life Technologies). pSkylan-NS–α-tubulin was created by exchanging the mScarlet sequence in the mScarlet–α-tubulin (Addgene plasmid #8504574) to Skylan-NS (Addgene plasmid #8678558) by Gibson assembly with a 0.005?U?µl?1 T5 exonuclease (M0663S, NEB), 0.033?U?µl?1 Phusion DNA polymerase (F-553L, Finnzymes) and 5.33?U?µl?1 TAQ DNA ligase (MB42601, NZYTEch) master mix. Live-cell imaging was performed 24–48?h later. Before live imaging, neurons were transferred to Hibernate medium E (Brainbits), supplemented with 2% B27, 2?mM Glutamax and 0.4% d-glucose, and maintained in a humid chamber at 36?°C for the duration of the experiments (Okolab).
Hibernate-E Medium 是由Brainbits廠家推出的一種無血清基礎營養培養基，專門用于在環境 CO? 條件下短期維持培養的大鼠神經元活力，以及長期保存存活的腦組織。國內代理商是靶點科技。Brainbits是該培養基配方的原始廠家。
主要特性與用途
•適用對象?：專為?胚胎神經組織?（embryonic neural tissue）設計。與之對應的是 Hibernate-A，后者適用于出生后及成年神經組織 。
•?環境適應性?：補充 B-27 和 GlutaMAX-I 后，允許研究人員在?環境 CO??（非 5% CO? 培養箱條件）下操作神經元至少 ?48 小時?，同時保持細胞高活力 。
•組織保存?：可用于在 4°C 條件下保存存活腦組織長達 ?1 個月?，也可作為運輸介質運送包括臍帶組織在內的各種生物樣本 。
•滲透壓差異?：Hibernate-E 與 Hibernate-A 配方相似，但 Hibernate-E 的滲透壓范圍較低，更適合胚胎神經元 。??
•維持生理功能?：研究表明，在環境 CO? 條件下使用 Hibernate-E 培養的神經元，其對谷氨酸誘導的細胞內鈣水平變化的反應能力與在標準 5% CO? 培養箱中培養的神經元相當，而普通 Neurobasal 培養基在環境 CO? 下會導致神經元活力大幅下降 。
•提高存活率?：與環境 CO? 下的 Neurobasal 培養基相比，使用 Hibernate-E 培養的胚胎大鼠皮層神經元在 4 天后活力損失小于 10% 。??
•補充劑?：使用前需無菌添加 ?B-27 Supplement? (2%) 和 ?GlutaMAX-I? 。
•儲存條件?：未開封或補充后的培養基應儲存在 ?2°C 至 8°C?，避光保存。補充后的培養基在黑暗中可穩定保存長達一周 。
•貨號信息?：常見規格為 500 mL，目錄號為HE-500? 。??
•授權代理商：靶點科技
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