Tissue-on-a-Chip: Microphysiometry With Human 3D Models on Transwell Inserts
微生理測量已被證明是用于監(jiān)測活細(xì)胞能量代謝以及細(xì)胞間相互作用的有利工具，該技術(shù)之前主要用于監(jiān)測二維的單分子細(xì)胞層。最近，我們的研究小組發(fā)現(xiàn)，微生理測量也可以自動檢測皮膚3D培養(yǎng)物的胞外酸化速率和跨上皮電阻值(TEER)，該培養(yǎng)物是培養(yǎng)在3D打印的封閉的生物芯片之中來維持氣液界面(ALI)。在這項工作中，我們提出了一種優(yōu)化的多通道芯片用于監(jiān)測商品化的3D小腸組織模型的TEER。實驗持續(xù)1天，60分鐘為重復(fù)周期，每個周期包括三個階段：(1)維護(hù)氣液界面(ALI)；(2)加入測量培養(yǎng)基或者試驗物；(3)清洗。初始平衡8小時后，加入細(xì)胞毒性和屏障破壞的化學(xué)物質(zhì)（0.2%十二烷基*），導(dǎo)致TEER隨時間變化逐步降低，而以前傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性測量方法是無法監(jiān)測到這種變化的。這項工作證實了使用自動氣液界面(ALI)的多通道實時監(jiān)測三維腸模型的TEER的可行性。培養(yǎng)的人體組織結(jié)合智能移動檢測技術(shù)，為在體外診斷提供了一個非常有前景的研究工具，特別是在毒理學(xué)，細(xì)胞代謝研究，藥物吸收等研究領(lǐng)域。
Keywords: microphysiometry, transepithelial electrical resistance, label-free monitoring, intestinal model, automated air–liquid interface
INTRODUCTION
盡管在藥物開發(fā)的臨床前階段進(jìn)行了完整的試驗，但未發(fā)現(xiàn)的毒性依然是臨床階段失敗的一個常見原因（Kola and Landis, 2004; Marx et al., 2016）。藥物毒性的研究之中，重要的一點(diǎn)就是要考慮小腸的吸收效應(yīng)。臨床前體內(nèi)評估通常依靠小鼠或大鼠模型來代表人類特征（Le Ferrec et al.， 2001）。然而，嚙齒動物模型不能可靠地預(yù)測藥物對于人體的各個方面的效應(yīng)，所以就可能出現(xiàn)對藥物毒性或再吸收的錯誤評估。因此，近年來的研究重點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到改善體外毒性研究。
在體外研究可重復(fù)性和分離影響變量的能力（Ferrick et al., 2008），有助于更好地理解毒性機(jī)制。但是2D細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系（Leonard et al., 2010; Ayehunie et al., 2018）有限的生理相關(guān)性和細(xì)胞培養(yǎng)實驗中缺乏全自動分析的問題已經(jīng)在之前的文獻(xiàn)中討論過（Gómez-Sj?berg et al., 2007; Meyvantsson et al., 2008; Li et al.,2013）。 3D細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的最新進(jìn)展解決了這些局限性，并提供了新的模型來增強(qiáng)對新藥安全性和有效性的信心（Fang and Eglen, 2017; Park et al., 2018）。采用“組織芯片"方法，通過體外培養(yǎng)的組織和器官模型，來改進(jìn)對吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的評估（Madden et al., 2018）。
從結(jié)腸（大腸）癌中提取的Caco-2單層細(xì)胞是一種廣泛應(yīng)用于體外藥物吸收和毒性評估的細(xì)胞系，它可以代表三個吸收途徑：跨細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)途徑）、細(xì)胞間（細(xì)胞外途徑）和載體轉(zhuǎn)運(yùn)。但是，細(xì)胞系和小腸組織的相關(guān)性有限。文獻(xiàn)中（Shah et al., 2006）已經(jīng)描述，它只能預(yù)測跨細(xì)胞（細(xì)胞內(nèi)途徑）滲透。此外，貼壁培養(yǎng)的單層Caco-2培細(xì)胞缺乏細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，不能模擬人小腸的多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)。為了克服這種生理相關(guān)性的不足，科學(xué)家開發(fā)了新的三維重建人體組織模型（Li et al., 2013; Ayehunie et al., 2018）。在空氣-液體界面（ALI）上培養(yǎng)三維小腸器官模型，彌補(bǔ)了體外培養(yǎng)的2D的形態(tài)學(xué)缺陷（Nossol et al.，2011）。
使用體外組織培養(yǎng)進(jìn)行藥物效應(yīng)分析的常用方法需要很多重復(fù)的組織樣本，還有繁瑣復(fù)雜的實驗步驟。方法和測量的復(fù)雜性導(dǎo)致需要大量的人工以及細(xì)胞或組織相關(guān)的硬件設(shè)備，而這些又有可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，增加結(jié)果的誤判（Blume et al.， 2010）。
相對手動測試，實時自動分析細(xì)胞存活率是一種更優(yōu)化的測量吸收和毒性的方案。此外，有了實時監(jiān)測的數(shù)據(jù)，就可進(jìn)行短期和長期的分析。對于長期的監(jiān)測，自動化設(shè)備取代人工更換培養(yǎng)基和添加試劑，以提高實驗的通量和重復(fù)性（Kempner and Felder, 2002）。總之，對細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行實時連續(xù)測量可以同時觀察到多個細(xì)胞代謝參數(shù)，并且支持ALI培養(yǎng)的自動化微流控系統(tǒng)。我們在該研究中提出了這樣的一個測試系統(tǒng)：組織芯片（tissue-on-a-chip）結(jié)合ALI培養(yǎng)細(xì)胞（圖1）。通過生物芯片以及3D打印封閉的培養(yǎng)腔體成功培養(yǎng)了3D重建人類小腸模型。
在這項工作中，我們提出了一個三通道、全自動的組織芯片測量系統(tǒng)（IMOLA-IVD，德國cellasys），該系統(tǒng)可以測量跨上皮細(xì)胞電阻（TEER），進(jìn)一步深入了解上皮細(xì)胞層的組織形態(tài)和屏障特性。值得注意的是，與之前描述的單通道芯片系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)在三個通道中都有一個自動的ALI，使用的細(xì)胞培養(yǎng)基更少（Alexander et al., 2018）。因此，現(xiàn)可以一次在三個的芯片上進(jìn)行平行實驗，例如：測試物，對照和空白。
MATERIALS AND METHODS
Human 3D Tissue Model
實驗采用重建的三維腸組織—EpiIntestinal-FT。這個基于人體細(xì)胞的3D組織整合了腸上皮細(xì)胞、Paneth細(xì)胞、M細(xì)胞、簇細(xì)胞和小腸干細(xì)胞以及人小腸成纖維細(xì)胞，它被培養(yǎng)在ALI模擬生理條件之中。EpiIntestinal-FT模型可以用來表征小腸功能的不同方面，包括屏障功能、代謝、炎癥和毒性反應(yīng)（Ayehunie et al ., 2018）。
Microphysiometric System
德國cellasys公司的IMOLA-IVD是一個由自動化微流控系統(tǒng)擴(kuò)展的微生理測量系統(tǒng)（Brischwein和Wiest, 2019）。該設(shè)備的詳細(xì)設(shè)置在之前的報告中有描述（Weiss et al.， 2013）。簡單地說，就是生物芯片上裝有兩個交叉電極結(jié)構(gòu)的電阻傳感器、兩個電化學(xué)的pH傳感器、一個電流的測氧傳感器和一個溫度傳感器。來自傳感器的測量數(shù)據(jù)被數(shù)字化記錄并傳輸?shù)接嬎銠C(jī)上的專有軟件—Data Acquisition and Link Application（DALiA）軟件。該軟件負(fù)責(zé)流體的數(shù)據(jù)的處理和流路的控制，使用一個定制化的開/關(guān)協(xié)議，以控制蠕動泵和微流控系統(tǒng)（雙向交界處的閥門）。使用這些工具可以并行監(jiān)控6通道IMOLA-IVDs同時獲得實時數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，例如測試物和陰性/陽性對照通道。
為了更好地使用和維護(hù)IMOLA-IVD和ALI，Alexander et al（2018）開發(fā)了一種新的封閉的培養(yǎng)腔設(shè)計，用Ultimaker 3D打印機(jī)打印的聚交酯并粘在生物芯片上。有了這種封閉的培養(yǎng)腔，就可以產(chǎn)生兩條不同的微流道：一條在培養(yǎng)腔頂端，一條是培養(yǎng)腔側(cè)面。通過一根頂端金電極和一根側(cè)面金電極傳感器可以測量在Transwell半透膜小室上培養(yǎng)的三維組織的TEER。
測量TEER的頻率為10kHz，外加電壓為30mv。結(jié)合密封腔的生物芯片和用于根尖線的射流頭如圖1所示。結(jié)合封裝的生物芯片和流路通道，如圖1所示。完整的設(shè)置如圖2所示。IMOLA suppo系rt 統(tǒng)(ISS-3)包括為IMOLA系統(tǒng)、用于控制流路系統(tǒng)的閥門的開關(guān)，以及用于記錄氣泡探測器數(shù)據(jù)的電子設(shè)備等提供電源。
DALiA客戶端軟件應(yīng)用程序用于控制測量和記錄的數(shù)據(jù)。泵、流路模塊和細(xì)胞培養(yǎng)液等IMOLA系統(tǒng)都被安裝在通用的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，保證整個實驗都在37?C。三個通道中的每一個都有兩條流路，一條是頂端，一條是側(cè)面，如圖3所示。兩種流路都可用于將多種物質(zhì)注射到細(xì)胞環(huán)境之中，如培養(yǎng)基和測試物。在這篇文章中，頂端流路可以引入兩種不同的物質(zhì)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和測試物。在TEER測量過程中，在培養(yǎng)的組織的頂端加入LBM低緩沖培養(yǎng)基，從而在頂端和基底側(cè)面（液體界面）之間建立一個導(dǎo)電連接。另外，頂端覆蓋了一層薄薄的培養(yǎng)基（空氣界面）（200nm）。基底側(cè)面流路定期向培養(yǎng)的組織的基底外側(cè)注入新的營養(yǎng)物質(zhì)。在本研究中，流路系統(tǒng)的連接如圖3所示。1號閥用于更換頂端培養(yǎng)基；2號閥負(fù)責(zé)插入的培養(yǎng)小室的頂端的填充或排空；3和4號閥門分別將頂端和基底側(cè)面的培養(yǎng)基注入到生物芯片或廢液瓶中，5和6號閥門交替切換到過濾的空氣。一個IMOLA-IVD使用6個閥門和單向模式控制的4個泵通道。這里展示的裝置使用三個IMOLA-IVD模塊平行地研究三個培養(yǎng)小室（三個生物芯片，每個都有一個頂端和一個基底側(cè)面）。
Assay Preparation for Verification
為驗證流路系統(tǒng)的設(shè)置和測量，可以用磷酸緩沖液（PBS）做預(yù)實驗。對于頂端和基底側(cè)面，使用滲透壓為300±10% mOsmol/kg的PBS溶液，通過頂端通道的試驗物質(zhì)為1000±10% mOsmol/kg的PBS溶液。
Assay Preparation for the EpiIntestinalTM Model
開始前，先將組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)以穩(wěn)定狀態(tài)。然后注入5 ml 基底側(cè)面培養(yǎng)基 SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)；頂端加入200 μl 的SMI-100-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories) ；然后在 37?C和5% CO2培養(yǎng)箱至少培養(yǎng)24 小時。實驗前，對整個系統(tǒng)進(jìn)行滅菌和培養(yǎng)液預(yù)灌流。所有管道和頂端通過2.5%的次氯酸（Sigma Aldrich, #71696, diluted with double-distilled H2O）消毒20分鐘進(jìn)行滅菌處理，生物芯片密封腔是通過浸潤在70%乙醇20分鐘進(jìn)行滅菌處理。隨后，基底側(cè)面和頂端注入培養(yǎng)基，對管道進(jìn)行預(yù)灌流處理。將整個系統(tǒng)和培養(yǎng)基放置在37?C和5% CO2培養(yǎng)箱之中過夜。最后，將含有小腸組織的培養(yǎng)小室放置在經(jīng)滅菌處理的生物芯片上。基底側(cè)面流路使用
SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)。頂端流路使用無緩沖DMEM (cellasys GmbH, Kronburg, Germany: SOP-G200-006; see supplement material) 和溶解在 DMEM之中的測試物。
最后使用濃度為0.2或2.0%的十二烷基*(SDS)作為破壞3D小腸組織屏障的物質(zhì)。在預(yù)先設(shè)定的灌流周期內(nèi)，確定了兩個流體通道的時間順序。TEER測量周期包括：35分鐘ALI，10分鐘TEER測量和15分鐘的清洗周期。第一個ALI周期用于流體系統(tǒng)的內(nèi)部預(yù)灌流，將程序設(shè)定為每個循環(huán)為1小時，持續(xù)灌流24小時。第8小時，將頂端培養(yǎng)基更換為含0.2% SDS的培養(yǎng)基，循環(huán)一個周期，然后更換為不含SDS的培養(yǎng)基。
RESULTS
Verification of the Measurement Procedure and the Fluidic System
每個TEER測量周期由測量階段和沖洗階段，循環(huán)程序的一致性可以確保整個監(jiān)測期間的變化肯定是由待測物引起的。每次TEER測量開始時，培養(yǎng)小室的頂端為空的，慢慢填充相應(yīng)的培養(yǎng)基。一旦達(dá)到足夠體積，TEER電極被浸沒在相應(yīng)的培養(yǎng)基之中，并開始夠測量電阻。使用PBS溶液進(jìn)行系統(tǒng)驗證的方法如圖4。TEER的振幅的最終標(biāo)準(zhǔn)值是244Ω。隨后加入測試物，電導(dǎo)率與PBS相比有所增高，電阻的振幅的準(zhǔn)值下降到132Ω。重新注入PBS后稀釋待測物，再吸出。如果沒有第二次注入PBS，測試物將一直保留在培養(yǎng)環(huán)境之中，持續(xù)影響細(xì)胞。如圖4所示，需要兩次清洗的循環(huán)才能除去測試物。結(jié)果表明，IMOLA-IVD裝置的灌流系統(tǒng)和傳感器的在整個測量過程之中工作正常。因此可得出結(jié)論，傳感器是精確穩(wěn)定的，振幅變化對應(yīng)于注入的PBS滲透壓的變化。
Control Experiments
為了驗證該設(shè)置，在一個IMOLA上設(shè)計了一個帶有正負(fù)對照的測試實驗。在不添加任何物質(zhì)的情況下監(jiān)測小腸組織的TEER值20小時（陰性對照），然后在2.0%SDS的影響下監(jiān)測20-28小時（陽性對照）。TEER測量每小時進(jìn)行一次。在每個測量周期中，TEER值可以用
PBS測量后期的平臺期的平均值來表示，如圖4所示。這些平臺期的平均值被整合成一個連續(xù)的TEER數(shù)據(jù)圖。圖5顯示了TEER值的大小和相位（左）以及實部和虛部（右）。
TEER值通常只顯示大小,但是，為了顯示所有的測量值，測量的阻抗在兩種常用坐標(biāo)系中充分顯示，即在極坐標(biāo)下（左）表示大小和相位，在笛卡爾坐標(biāo)下（右）表示實部和虛部。其數(shù)學(xué)表達(dá)式如公式1所示：
Tissue-on-a-Chip Model
Figure 6 加入0.2% SDS 的腸組織模型。經(jīng)過開始的5小時，TEER達(dá)到270Ω的平均值。第8小時加入測試物SDS，TEER迅速上升，隨后線性降低，在第18小時降到到225Ω。需要注意的是，SDS不會改變細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓濃度。測定的0、0.2和2.0% SDS的培養(yǎng)基的滲透壓濃度 (OSMOMAT 030, Gonotec, Berlin, Germany) 基本一致(300±5% mOsmol/kg)。
CONCLUSION
在這里，我們提出了原理證明實驗使用三通道微生理測量系統(tǒng)測量重建腸上皮模型的TEER與ALI。參數(shù)的測量是非侵入性的、實時的，并且系統(tǒng)定期自動更新培養(yǎng)基。在TEER測量中，培養(yǎng)小室的頂部也注入培養(yǎng)基。PBS和2.0% SDS的驗證實驗也證實了該測量方法和系統(tǒng)。
8 h后加入測試物（0.2% SDS）后發(fā)現(xiàn)TEER呈下降趨勢。在未來的工作中，我們建議進(jìn)行后續(xù)實驗，使用測試物和微傳感器來獲取pH值和溶解氧的數(shù)據(jù)(Wiest et al.，2016)。
總的來說，IMOLA-IVD系統(tǒng)已被證明是一種靈靈活、可定制的系統(tǒng)，用于分析各種細(xì)胞培養(yǎng)物模型，包括貼壁的2D細(xì)胞系，3D球狀體，以及用于重構(gòu)人類表皮和腸的組織/類器官芯片。未來的工作將包括研究和優(yōu)化灌流循環(huán)(例如，增加測試物質(zhì)之前的穩(wěn)定期的時間)和電極幾何形狀，以及光譜測量信息的收集（Gilbert et al., 2019; van der Helm et al., 2019），以建立一種可用于肺或其他粘液細(xì)胞模型的多功能的組織芯片的研究工具。
DATA AVAILABILITY STATEMENT
The datasets generated for this study are available on request to the corresponding author.
AUTHOR CONTRIBUTIONS
All authors listed have made a substantial, direct and intellectual contribution to the work, and approved it for publication
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