一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱，不能液化明膠、不產(chǎn)生吲哚、革蘭氏陽性、無運動、無芽孢、觸酶陰性、硝酸還原酶陰性及細(xì)胞色素氧化酶陰性反應(yīng)的細(xì)菌。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和嗜熱鏈球菌（Stre ptococcus thermophilus)。

設(shè)備和材料

恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

冰箱：2℃~5℃。

均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。

天平：感量0. 01 g。

無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

無菌吸管：1mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。

無菌錐形瓶：500 mL、250 mL

設(shè)備和材料

恒溫培養(yǎng)箱：36°C士1°C。

厭氧培養(yǎng)裝置：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐、厭氧袋或能提供同等厭氧效果的裝置。

冰箱：2°C~8°C。

均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋均質(zhì)杯或滅菌乳缽。渦旋混勻儀。

電子天平：感量0.001 g。

實時定量PCR儀。恒溫水浴鍋或金屬浴。

離心機(jī)：離心力> 10 000Xg。

無菌試管：18 mmX180 mm.15 mmX100 mm。

無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）10 mL（具0.1 mL刻度）。

微量移液器和滅菌吸頭：2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。

無菌錐形瓶：500 mL、250 mL。無菌平皿：直徑90 mm。

PCR管。

培養(yǎng)基和試劑

4.1生理鹽水：見A.1。

4.2MRS（ManRogosaSharpe）培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）和半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）改良MRS培養(yǎng)基：見A.2和A.3。

4.3 MC 培養(yǎng)基（ ModifiedChalmers 培養(yǎng)基）：見A.4。

4.4 0.5%蔗糖發(fā)酵管：見A.5。

4.4 0.5%纖維二糖發(fā)酵管：見A.5。

4.6 0.5%麥芽糖發(fā)酵管：見A.5。

4.7 0.5% 甘露醇發(fā)酵管：見A.5。

4.8 0.5%水楊苷發(fā)酵管：見A.5。

4.9 0.5%山梨醇發(fā)酵管：見A.5。

4.10 0.5% 乳糖發(fā)酵管：見A.5。

4.11七葉苷發(fā)酵管：見A.6。

4.12革蘭氏染色液：見A.7。

4.13莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學(xué)純。

4.14半胱氨酸鹽酸鹽（CysteineHydrochloride）：純度>99%。

培養(yǎng)基和試劑

4.1 稀釋液：見附錄A中A.1

4.2 MRS（Man Rogosa Sharpe)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.2。

4.3莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin)和半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）改良MRS瓊脂培養(yǎng).基：見附錄A中A.3。

4.4 MC（Modified Chalmers）瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.4。

4.5 0.5%蔗糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。

4.6 0.5%纖維二糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。

4.7 0.5%麥芽糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。

4.8 0.5%甘露醇發(fā)酵管：見附錄A中A.5。

4.9 0.5%水楊苷發(fā)酵管：見附錄A中A.5。

4.10 0.5%山梨醇發(fā)酵管：見附錄 A中A.5。

4.11 0.5%乳糖發(fā)酵管：見附錄A中A.5。

4.12七葉苷發(fā)酵管：見附錄A中A.6。

4.13 革蘭氏染色液：見附錄A中A.7。

4.14生理鹽水：見附錄A中A.8。

4.15 DNA提取液：見附錄A中A.9。

4.16 10XPCR緩沖液：見附錄A中A.10。

4.17莫匹羅星鋰鹽(C₂₆H₄₃O₉Li）：化學(xué)純。

4.18半胱氨酸鹽酸鹽(C₃H₈CINO₂S）：純度> 99%。

4.19 dNTPs。4.20 Taq DNA聚合酶：5 U/pL。

4.21 七種乳酸菌引物探針。

4.22 滅菌去離子水。

檢驗程序

樣品制備

新增：（1）6.1.2稀釋液在試驗前應(yīng)在36℃士1℃條件下充分預(yù)熱15 min~30 min。

（2）6.1.6經(jīng)特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌食品樣品應(yīng)在相應(yīng)技術(shù)/工藝要求下進(jìn)行有效前處理。

更改：（1）樣品稀釋改用稀釋液。

（2）樣品處理均質(zhì)參數(shù)改為：8 000×g~10 000×g均質(zhì)l min~2 min。

（3）液體樣品增加均質(zhì)器拍打方式。

步驟

稀釋及培養(yǎng)

新增：

6.2.3 經(jīng)特殊技術(shù)(如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌食品應(yīng)按照相應(yīng)技術(shù)/工藝要求進(jìn)行稀釋。

雙歧桿菌計數(shù)

根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至 48℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)72 h±2 h，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

雙歧桿菌計數(shù)

根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48℃~50℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注人平皿15 mL~20 mL.轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36℃士1℃厭氧培養(yǎng)，根據(jù)雙歧桿菌生長特性一般選擇培養(yǎng)48 h,若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h.培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

嗜熱鏈球菌計數(shù)

根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48℃的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36℃±1℃需氧培養(yǎng)72 h±2 h，培養(yǎng)后計數(shù)。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm±1 mm，菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

嗜熱鏈球菌計數(shù)

根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48℃～50℃的MC瓊脂培養(yǎng)基及時傾注入平皿15 mL~20 mL轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36℃±1℃有氧培養(yǎng)，根據(jù)嗜熱鏈球菌生長特性，般選擇培養(yǎng)48 h，若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm±1 mm,菌落背面為粉紅色。

乳桿菌計數(shù)

根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36℃±1℃厭氧培養(yǎng)72 h±2 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

乳桿菌計數(shù)

根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計，選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48℃~50℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注人平皿15 mL~20 mL.轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。培養(yǎng)基凝固后倒置于36℃士1℃厭氧培養(yǎng),根

據(jù)乳桿菌生長特性，一般選擇培養(yǎng)48 h.若菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72 h。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

菌落計數(shù)

注：可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位(colony-formingunits，CFU）表示。6.3.1選取菌落數(shù)在30 CFU~300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。

6.3.2其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，,代表一個平板菌落數(shù)。

6.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。

菌落計數(shù)

見GB 4789.2菌落計數(shù)部分。

6. 4 結(jié)果的表述

6.4.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克或每毫升中菌落總數(shù)結(jié)果。

6.4.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按式（1）計算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d……（1）

6.4.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。

6.4.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度最di的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

6.4.5若所有稀釋度(包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最di稀釋倍數(shù)計算。

6.4.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU~300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU時，則以最jie近30 CFU或300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

結(jié)果的表述

見GB 4789.2計算方法部分。

菌落數(shù)的報告

6.5.1菌落數(shù)小于100 CFU時，按“四舍五入"原則修約，以整數(shù)報告。

6.5.2菌落數(shù)大于或等于100 CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入"原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入"原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。

6.5.3稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。

菌落數(shù)的報告

見GB 4789.2菌落總數(shù)的報告部分。

純培養(yǎng)

挑取3個或以上單個菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板,乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板，置36℃±1℃ 厭氧培養(yǎng)48 h。

純培養(yǎng)

挑取3個或以上單菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，置36℃士1℃有氧培養(yǎng)48 h,乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板置36℃士1℃厭氧培養(yǎng)48 h。

涂片鏡檢

乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣,呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無芽胞,革蘭氏染色陽性。

嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑為0.5 μm~2. 0 μ m，成對或成鏈排列，無芽胞，革蘭氏染色陽性。

涂片鏡檢

嗜熱鏈球菌菌體鏡下呈球形或球桿狀，直徑為0.5 μm~2.0 μm，成對或成鏈排列，無芽孢，革蘭氏染色陽性。乳桿菌屬鏡下菌體形態(tài)多樣，呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性。

實時熒光PCR法鑒定

無

實時熒光PCR法鑒定

新增內(nèi)容，見附錄1。

培養(yǎng)基及試劑

無

培養(yǎng)基及試劑

新增：

（1）稀釋液

NaCl 8.5

胰蛋白胨 15.0

將上述成分加入到1000 mL蒸餾水中，加熱溶解，分裝后121℃高壓滅菌15 min。

（2）DNA提取液

chelex粉末 0.1 g

將上述成分加入到100 mL蒸餾水中混勻

（3）10×PCR緩沖液

KCl 1.49

MgCl₂ 0.14

Tristan-HCl（pH=8.8） 20 mL

將上述成分加入到80 mL蒸餾水中混勻，分裝后121℃高壓滅菌15 min。

培養(yǎng)基及試劑

MRS培養(yǎng)基

蛋白胨 10.0

牛肉浸粉 5.0

酵母浸粉 4.0

葡萄糖 20.0

吐溫80 1.0 mL

K₂HPO₄·7H2O 2.0

醋酸鈉·3H2O 5.0

檸檬酸三銨 2.0

MgSO₄·7H₂O 0.2

Mn SO₄·4H₂O 0.05

瓊脂粉 15.0

將上述成分加入到1000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2，分裝后121℃高壓滅菌15 min～20 min。

培養(yǎng)基及試劑

MRS瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨 10.0

牛肉浸粉 10.0

酵母浸粉 5.0

葡萄糖 20.0

吐溫80 1.0 mL

K₂HPO₄·7H₂O 2.0

醋酸鈉·3H₂O 5.0

檸檬酸三銨 2.0

MgSO₄·7H₂O 0.1

Mn SO₄·4H₂O 0.05

瓊脂粉 15.0

將上述成分加入到1000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.2±0.2，分裝后121℃高壓滅菌15 min。

培養(yǎng)基及試劑

MC培養(yǎng)基

大豆蛋白胨 5.0

牛肉浸粉 3.0

酵母浸粉 3.0

葡萄糖 20.0

乳糖 20.0

碳酸鈣 10.0

瓊脂 15.0

1%中性紅溶液 5.0 mL

將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0±0.2，加入中性紅溶液。分裝后121℃高壓滅菌15 min～20 min。

培養(yǎng)基及試劑

MC瓊脂培養(yǎng)基

大豆蛋白胨 5.0

牛肉浸粉 5.0

酵母浸粉 5.0

葡萄糖 20.0

乳糖 20.0

碳酸鈣 10.0

瓊脂 15.0

1%中性紅溶液 5.0 mL

將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0±0.2，加入中性紅溶液。分裝后121℃高壓滅菌15 min。

培養(yǎng)基及試劑

（1）乳酸桿菌糖發(fā)酵管

按 0.5%加入所需糖類，并分裝小試管，121℃高壓滅菌15 min~20 min。

（2）七葉苷培養(yǎng)基

將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，

121℃高壓滅菌15 min~20 min。

（1）乳桿菌糖發(fā)酵管

按0.5%加入所需糖類，并分裝小試管，121℃高壓滅菌15 min。

（2）七葉苷培養(yǎng)基

將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，121℃高壓滅菌15 min。

三、變化解讀

從對比表中不難看出，新版標(biāo)準(zhǔn)中，

（1）術(shù)語和定義，更加具體wan善，明確列出乳酸菌是“不能液化明膠、不產(chǎn)生吲哚、革蘭氏陽性、無運動、無芽孢、觸酶陰性、硝酸還原酶陰性及細(xì)胞色素氧化酶陰性反應(yīng)的細(xì)菌"；

（2）設(shè)備和材料中，設(shè)備增加了“厭氧培養(yǎng)裝置：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐、厭氧袋或能提供同等厭氧效果的裝置"，“實時定量PCR儀、恒溫水浴鍋或金屬浴、離心機(jī)：離心力>10000×g"，“無菌平皿：直徑90 mm"、“PCR管"，同時對冰箱的溫度范圍和移液器吸頭的的量程及電子天平的精確度都做了wan善或調(diào)整；

（3）樣品處理過程中，引入了“稀釋液"，不再使用“生理鹽水"；

（4）檢驗程序中，增加了“乳桿菌計數(shù)"的操作步驟，所有的培養(yǎng)時間均由原來的“72 h±2 h"改成“48 h-72 h"。

（5）稀釋和培養(yǎng)過程中，新增了“經(jīng)特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的含乳酸菌食品應(yīng)按照相應(yīng)技術(shù)/工藝要求進(jìn)行稀釋"；

（6）培養(yǎng)基的溫度，由“48℃"，改為“48℃~50℃"，培養(yǎng)基的傾注量，由“15 mL"改為“15 mL~20 mL"；

（7）菌落計數(shù)和結(jié)果表述及報告，均簡化描述，直接與GB4789.2對接，采用“見GB 4789.2"相關(guān)部分這種表述方式；

（8）菌種純培養(yǎng)，描述為“嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，置36℃士1℃有氧培養(yǎng)48 h，乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板置36℃士1℃厭氧培養(yǎng)48 h"更加準(zhǔn)確。

（9）菌種鑒定，引入實時熒光PCR法。

（10）除了新增鑒定方法外，對重要的培養(yǎng)基配方也進(jìn)行了優(yōu)化，常用的MRS、MC培養(yǎng)基，在配方和制備條件上都有更新，舊標(biāo)準(zhǔn)中所有的高壓滅菌條件均為121℃高壓滅菌15 min~20 min，新版標(biāo)準(zhǔn)中，全部改為“121℃高壓滅菌15 min"。

四、新產(chǎn)品展示

順應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的更新，我們對相關(guān)培養(yǎng)基也做了變更，除正常銷售現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（2016版）配套培養(yǎng)基外，還及時引入了新標(biāo)準(zhǔn)（2023版）中新增和有所變化的培養(yǎng)基，現(xiàn)將對應(yīng)的產(chǎn)品信息列入下表（表2），相關(guān)人員可根據(jù)自己的實際情況選擇購買、使用。表2 新舊標(biāo)準(zhǔn)中涉及的部分培養(yǎng)基及編號

序號	現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（2016版）		新標(biāo)準(zhǔn)（2023版）
序號	名稱	貨號	名稱	貨號
1	MRS培養(yǎng)基	HB0384-5	MRS瓊脂培養(yǎng)基	HB0384-51
2	莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良 MRS 培養(yǎng)基	HB0384-11	莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS瓊脂培養(yǎng)基	HB0384-111
3	MC培養(yǎng)基	HB0383	MC瓊脂培養(yǎng)基	HB0383-4
4	0.85%生理鹽水	/	稀釋液	HB9272

GB 4789.35新舊標(biāo)準(zhǔn)變化比較詳解

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