近年來，解析大腦皮層分層神經環路的動態活動規律，是神經科學領域的核心研究方向。大腦皮層不同神經元承擔著差異化的信息編碼與決策調控功能，因此闡明自由行為狀態下皮層分層神經元的協同活動機制，是揭示感知、決策及運動調控背后神經機理的核心前提。

傳統在體成像技術存在顯著且難以規避的技術短板，極大限制了多層皮層神經活動的同步觀測能力。其中，單光子成像技術的組織穿透深度有限；傳統頭戴式雙光子顯微鏡僅能實現單一皮層平面的單次記錄，依托電控可調透鏡開展逐層掃描的成像模式，會顯著犧牲時間分辨率，無法同步捕捉大腦深淺層神經元的動態活動。三光子成像雖可實現深層皮層成像，但難以與淺層雙光子光路兼容整合。兩套獨立成像系統因體積大、布線復雜、重量偏高，會嚴重干擾小鼠的自然運動行為，無法支撐間隙跨越等復雜決策行為的觀測研究。

近日，德國馬克斯·普朗克神經生物學研究所團隊在《Nature Methods》發表題為“Simultaneous two- and three-photon multiplane imaging across cortical layers in freely moving mice"創新性研究成果，成功研發出輕量化頭戴式雙/三光子復合多平面顯微鏡。該設備可在小鼠自由運動時，對其大腦5個垂直皮層進行近乎同步的鈣信號采集。單次實驗可穩定采集超1800個神經元的活動信號，明確揭示了后頂葉皮層不同層神經元在決策行為中的功能時序差異。

本研究研發的多平面顯微系統，融合雙光子與三光子激光技術，可適配小鼠大腦皮層不同深度的成像需求。其中960 nm雙光子激發用于皮層淺層成像，1300 nm三光子激發具備更強的穿透性，適配皮層深層成像，兩種成像模式的深度分界為皮層下450 μm。系統可獨立調控激光能量配比，有效均衡不同成像層級的信號強度，保障成像質量統一。

該系統依托時間復用技術，實現多平面近乎同步的成像效果。雙光子激光通過偏振分光結構分出四路獨立光路，各光路脈沖依次設置8ns延時，分別接入四根空芯光纖。這四根光纖統一收納于1.25 mm的3D打印套管內，套管由摩方精密microArch® S230（精度：2 μm）3D打印系統加工制成；三光子激光則通過單獨光纖傳輸。五根光纖的端頭軸向位置差異化排布，經光學聚焦后，可在樣本內部形成五個軸向獨立的成像焦平面。其中四個雙光子成像平面軸向間距為80 μm，總覆蓋深度達240 μm，結合獨立的三光子深層成像平面，可完整覆蓋小鼠大腦皮層的多個功能層級。

成像模塊搭載微型機電掃描組件，二維成像最大視場為450×600 μm，標準成像幀率可達9.73 Hz，同時配備高速成像模式，可在小視場范圍內實現更快成像。熒光信號采集采用雙通道硅光電倍增管檢測結構，借助激發脈沖的時間差異設置信號積分窗口，實現單探測器對五個成像平面的信號拆分，無需額外空間分光裝置，大幅縮減頭戴設備的體積與重量，整機重量僅2.5 g。系統內置兩組電動調焦透鏡，可分別統一調節所有成像平面的整體深度、單獨微調雙光子與三光子平面的相對位置，能夠精準定位目標神經元集群，滿足長期追蹤觀測的實驗需求。

由于時間復用的脈沖時間間隔較短，再結合探測元件、傳輸線纜本身的信號滯后特性，先激發通道的熒光余輝會單向滲漏至后續成像通道，引發通道串擾，降低圖像對比度與信號采集精度。研究團隊設計迭代式串擾校正算法，依靠像素相關系數計算各通道干擾權重，逐層剔除前置通道帶來的干擾分量，以此削弱串擾偽影。

基于熒光微球測得系統光學分辨率：雙光子光路橫向、軸向分辨率分別為 1.45 μm、22.2 μm；三光子光路橫向 1.30 μm、軸向 14.8 μm，分辨率足以實現單細胞胞體觀測?；铙w測試結果表明，該系統單次成像最多可同步采集超1800個神經元信號，不同皮層深度的雙光子成像層均可保持均勻的信噪比與鈣瞬變幅值。

為驗證設備長期成像穩定性，本研究間隔數日對同一只小鼠后頂葉皮層神經元重復觀測。各成像平面神經元輪廓辨識度良好，跨時段可精準匹配同一細胞，且鈣信號波動規律基本重合；最長間隔18天的追蹤實驗同樣能穩定采集神經元活動信號。并針對多光纖束拖累小鼠運動的缺陷，本裝置搭配配重懸吊結構，大幅減輕頭部承受的線纜負重。行為對照實驗顯示，搭載多平面顯微鏡的小鼠，平均移動速度、跑動時長占比、總活動路程，與僅佩戴定位標記的對照組無統計學差異；單光纖、五光纖線纜組的動物運動特征也未見明顯區分。頭部角加速度定量結果表明，顯微鏡僅輕微改變頭部轉動幅度，不影響小鼠完成間隙跳躍等復雜行為。

為了進一步探究小鼠在后頂葉皮層縫隙穿越決策任務中的層間神經元活動差異，本實驗設置行為范式：小鼠需要判斷兩座高臺的間距，通過跳躍抵達目標平臺以獲得谷物獎勵；單次成像記錄時長約10分鐘，能夠完整捕捉多次跳躍決策期間，小鼠后頂葉皮層2/3層與第5層神經元的鈣信號變化。實驗借助相機同步追蹤小鼠運動軌跡，劃分并標記全部行為階段，以小鼠落至目標平臺的時間點作為統一參照，對齊所有神經元的熒光動態時序。

實驗觀測到，后頂葉皮層2/3層大量神經元在跳躍前、跳躍途中以及落地后均持續發放活動信號；第5層神經元的激活則集中在跳躍完成、獲取獎賞的決策后半段。按照神經元活動啟動的先后順序對細胞分類統計，量化各行為階段具備時序響應特征的神經元密度：在跳躍前后各5秒的時間區間內，2/3層時序相關神經元密度顯著高于隨機打亂時序的對照樣本；第5層僅在落地后的5秒區間出現時序神經元密度明顯升高。分層對比結果表明，決策行為啟動前，2/3層參與時序編碼的神經元數量遠高于第5層，說明小鼠自主決策過程里，后頂葉皮層不同分層的神經元具備截然不同的時序編碼規律。

總結：本研究開發了一套頭戴式雙/三光子復合多平面顯微鏡，可同步捕捉自由活動小鼠皮層深淺區域大量神經元的動態活動，支持對特定神經元集群開展數周持續性觀測追蹤。未來可通過擴充成像層數、提升光纖集成性能，并聯合光遺傳刺激模塊構建成像調控一體化系統，助力神經環路底層作用機制的深入研究。