三維腫瘤類器官能夠較好保留患者原始腫瘤組織的遺傳、轉錄、組織學及藥物反應特征，近年來已逐漸成為腫瘤生物學研究、抗腫瘤藥物篩選以及個體化治療的重要體外模型。然而，傳統類器官培養通常依賴Matrigel膠滴法（DOME）。由于類器官在膠滴中的位置、尺寸及生長狀態難以精準控制，不同類器官之間容易出現明顯的形態異質性，同時還存在成像焦平面不一致、類器官融合以及藥物反應波動較大的問題，這些因素均會影響類器官藥敏檢測的標準化和重復性。

針對上述問題，武漢大學陳璞教授團隊聯合武漢大學中南醫院等單位，開發了一種基于3D打印微孔陣列的高通量結直腸癌類器官芯片（CRCO CHIP），通過對單個類器官形成、生長和藥物反應進行空間限制和原位監測，為單類器官水平的精準藥敏評價提供了新的技術方案（圖1）。研究成果以“High-throughput colorectal cancer organoid-on-a-chip for single-organoid-analysis-based personalized drug evaluation"為題發表于《Bio-Design and Manufacturing》。該平臺可在標準96孔板體系中實現高通量類器官培養，每個培養孔中集成19個規則排列的微孔結構。

研究團隊首先從微孔陣列的幾何結構設計入手，對芯片進行了系統工程化優化。每個微孔具有1000 μm開口、600 μm底部直徑以及500 μm高度，并采用弧形底部結構，以促進細胞向微孔底部聚集并形成單一類器官。與此同時，團隊進一步結合粒子沉降、流體剪切力以及氧擴散模擬，對微孔內部的細胞聚集和微環境進行了表征。模擬結果顯示，細胞可在較短時間內沉降至微孔底部，而微孔底部維持較低剪切力環境，并可隨著類器官生長形成局部氧梯度。

在芯片模具加工方面，研究團隊采用了摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）技術制備。首先使用SolidWorks完成微孔陣列結構設計，隨后通過摩方精密microArch® S230（精度：2 μm）高精度DLP 3D打印設備對耐高溫樹脂（HTL）進行3D打印，獲得具有復雜微尺度結構的樹脂母模。打印后的母模經低黏附處理后進一步用于PDMS翻模，最終制備出可嵌入96孔板的PDMS微孔陣列芯片（圖2）。該技術路線充分利用了高精度3D打印在復雜微結構快速制造方面的優勢，避免了傳統微納加工在結構設計、制模周期和成本方面的限制，也為微孔陣列參數的快速迭代提供了基礎。

在培養條件優化階段，研究人員首先使用HT-29細胞確定微孔內穩定形成腫瘤球所需的起始細胞量。結果顯示，相比50 cells/microwell，100 cells/microwell能夠形成更加穩定且均一的腫瘤球。隨后，在患者來源結直腸癌類器官中進一步比較2%、5%和10% Matrigel條件，最終確定100個細胞/微孔聯合5% Matrigel為較優培養條件。

在這一條件下，CHIP組類器官可在培養早期形成相對獨立、均一的結構，并在后續培養過程中保持良好的形態穩定性。與傳統DOME培養相比，CHIP組類器官的面積、Feret直徑以及圓度均表現出更低的離散程度，其形態學變異系數整體維持在較低水平。同時，芯片培養體系還減少了Matrigel的使用量，并有效避免傳統膠滴培養中常見的類器官隨機融合現象，為單個類器官連續追蹤提供了基礎（圖3）。

除了形態學均一性，研究團隊還進一步評價了CHIP培養類器官的病理學和分子表型。H&E及免疫組化結果顯示，CHIP和DOME培養的CRCOs均能夠保留與原始腫瘤組織相似的結構特征，并表達CK20、Ki67等相關標志物。進一步的全類器官免疫熒光分析顯示，CHIP培養的類器官保留了CK20、MUC2、CDX2、β-catenin等結直腸上皮及腫瘤相關特征。值得注意的是，CHIP組CD44表達水平較高，提示其微環境可能更有利于部分腫瘤干性表型的維持（圖4）。

在此基礎上，研究人員進一步評估了該芯片在個體化藥物敏感性檢測中的應用潛力。研究選取患者來源CRCO，對5-氟尿嘧啶（5-FU）和瑞戈非尼進行藥物處理，并同時采用傳統終點活性檢測和基于類器官面積變化的無標記形態學分析。由于CHIP能夠將單個類器官限制在固定微孔內，研究人員可以連續追蹤同一類器官的面積和形態變化，從而避免DOME培養中由于類器官位置變化、融合以及尺寸差異帶來的干擾。

進一步結果顯示，CHIP平臺能夠獲得更加穩定的藥物劑量-反應曲線，并支持對IC50進行定量分析。研究還將基于類器官面積變化得到的IC50與CellTiter-Glo 3D檢測結果進行比較。在CHIP平臺中，兩種檢測方式獲得的結果具有較好一致性，而傳統DOME培養中兩種方法之間存在更明顯差異，說明規則、均一并且可原位成像的單類器官培養模式有望提高無標記形態藥敏分析的可靠性（圖5）。

相比傳統膠滴培養方式，該CRCO CHIP的一個重要特點在于將高精度制造、標準化類器官培養和單類器官分析進行了整合。通過3D打印快速制造具有特定幾何結構的微孔陣列，使每一個類器官都能夠在相對獨立且可定位的微環境中形成，從而提高了類器官培養的一致性，并為后續自動化顯微成像、無標記動態監測以及高通量藥敏分析創造了條件。

此外，該平臺能夠在較低起始細胞量條件下開展類器官構建，對于臨床活檢等樣本量有限的場景具有潛在優勢。文章提出，未來還可進一步將該平臺與人工智能圖像分析技術結合，對類器官收縮、膜起泡等動態表型進行高內涵分析，并進一步擴展至自動化和規模化的個體化藥物篩選。

總結：本研究利用摩方精密微納3D打印技術完成微孔陣列樹脂母模的高精度制造，并進一步構建了適配標準96孔板的CRCO CHIP。該平臺實現了低起始細胞量條件下的單類器官形成、規則化空間定位和原位連續觀察，并在結直腸癌類器官藥敏評價中表現出良好的重復性和應用潛力。研究展示了高精度3D打印與類器官工程結合在精準腫瘤模型構建和個體化藥物篩選中的應用價值，也為未來自動化、高通量類器官分析平臺的開發提供了新的技術路徑。