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不同蛋白濃度測定方法優缺點

時間：2022/3/7閱讀：12465

1. BCA法測定試劑盒

堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。不方便的是這種方法需要提前制作標準曲線。BCA蛋白質測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩定性俱佳。BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質濃度檢測，可兼容高達5%的SDS，TritonX-100及Tween等。然而，由于BCA方法依靠銅離子進行顯色反應，如果溶液中含有與銅離子反應的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、β-巰基乙醇，結果將受到很大程度的影響。同時，BCA方法的檢測結果也會受到蛋白質內半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影響。

2. Bradford法

該方法的原理是，帶負電的考馬斯亮藍染料與蛋白質中堿性氨基酸相互作用。考馬斯亮藍在溶液中顯紅色，吸收峰在465nm處，當與蛋白質結合后，其顯藍色，在595nm處有吸收峰。595nm處的吸光值與蛋白質的濃度呈正比。

Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。樣品中巰基乙醇的濃度可高達1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達5mM。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。

3. UV280法

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

1）簡易經驗公式

蛋白質濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

2）精確計算

通過計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計算最終結果：

蛋白質濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d為測定OD值比色杯的厚度

D為溶液的稀釋倍數

4. Lowry法

蛋白質在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，在一定條件下，利用藍色深淺與蛋白質濃度的線性關系作標準曲線并測定樣品中蛋白質的濃度。

5、考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法

考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

考馬斯亮藍G―250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質通過范德華力結合，在一定蛋白質濃度范圍內，蛋白質和染料結合符合比爾定律（Beer’s law）。此染料與蛋白質結合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。

蛋白質和染料結合是一個很快的過程，約2min即可反應*，呈現最大光吸收，并可穩定1h，之后，蛋白質―染料復合物發生聚合并沉淀出來。蛋白質―染料復合物具有很高的消光系數，使得在測定蛋白質濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質5µL/ml時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10-100µg蛋白質，微量測定法測定范圍是1－10µg蛋白質。此反應重復性好，精確度高，線性關系好。標準曲線在蛋白質濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質結合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。

此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無干擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色干擾，這可以用適當的緩沖液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2―巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如 Triton X―100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當的緩沖液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除。

不同蛋白濃度測定方法優缺點

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