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天地人和----大孔聚合物微球在大分子純化中的應用

時間：2024/12/24閱讀：2516

隨著生物醫藥的發展，近年來各種大分子藥物不斷涌現，如蛋白三聚體、IgM分子、病毒及病毒樣顆粒、質粒、外泌體等，因此此類生物大分子的分離純化的需求也日益增加。

傳統的層析填料如多糖基質，雖具有生物相容性好、比表面積高、化學穩定性好等特點，但其質地軟、孔徑小（一般在100 nm以下）的性質，容易造成樣品傳質速率慢、分離時間長，樣品活性降低等問題。因此，發展快速、高效的分離技術至關重要。大孔聚合物微球因其高比表面積、高機械強度和多樣表面特征，常被用作層析分離純化的填料。目前，已發展出多種表面基團及不同孔徑的聚合物層析填料，成功應用于疫苗、病毒、抗體、酶、細胞因子等的分離純化，能有效的解決大分子蛋白純化中遇到的問題。

大孔聚合物微球的優勢

填料孔徑的大小會限制大分子物質的吸附?：生物大分子如乙肝抗原、類病毒在層析純化時，受孔徑限制，大分子難以進入填料內部，影響吸附載量，而?增大孔徑則可以提高載量。大孔聚合物填料孔徑（有100/500/1000 nm），允許大分子進入內部孔道，從而顯著提高吸附載量。例如，定制化大孔DEAE填料對HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）的吸附載量幾乎是瓊脂糖DEAE填料的20倍，有助于提高純化效率。?傳統填料內部孔道狹窄，導致傳質阻力大，層析柱壓力高，這對于生物大分子的傳質速率、分離效率和結構保持都產生了不利影響。大孔填料中存在對流孔，這有效克服了傳統填料的缺點。對流孔的存在使得孔內傳質方式主要為對流，在提高流速和傳質效率方面具有顯著優勢，有效解決了樣品因暴露在不穩定環境中的時間過長而活性降低的問題，從而提高樣品的活性回收率和產率。大孔聚合物填料的優點總結如下圖所示。

大孔聚合物微球在生物大分子純化中的應用

因其孔徑大、有利于保持生物大分子的結構、?機械強度高、?處理量大等顯著的純化優勢，大孔聚合物微球在生物制藥領域中被廣泛應用于各種生物大分子的純化和分離。例如Q 70M/L Phamc Beads超大孔陰離子交換層析介質，粒徑70μm，具有超大孔（500/1000nm）結構，在質粒三步法純化工藝中可有效去除痕量雜質及內毒素，其工藝路線見下圖。

質粒三步層析法能夠實現scDNA和ocDNA的全部分離，該方法穩健高效、高收率（樣品收率＞90%），高純度（純度＞95%），滿足了生物制藥和基因治療等領域對高純度質粒DNA的需求。又如在AAV工藝開發中超大孔陰離子交換層析介質能夠讓病毒進入微球內部被吸附，并且更大的保持病毒外殼的完整性，同時提高收率，達到收獲高純度病毒的目的。?AAV純化是基因治療中獲取高純度腺相關病毒（AAV）的關鍵步驟?。AAV純化策略的主線：澄清、捕獲、純化和精純。在收獲和細胞裂解后，通過離心、過濾等方法去除細胞碎片和雜質。AAV的純化方案主要有以下三種（見下圖），可以獲得完整和更純凈的AAV。

這三種方案中，方案一、二是對AAV病毒更經濟、更便捷的純化方案，方案三為常用方法，AAV病毒親和純化填料，效果很好但是價格高。此外大孔聚合物微球還應用在疫苗（滅活病毒、病毒樣顆粒）、抗體、血液制品（細胞因子、丙球蛋白）等，應用的程度也是越來越高，其具體應用如下圖所示。

應用案例

① 大孔聚合物層析介質用于人抗的分離純化

填料的孔徑越大，蛋白分子能夠進入并接觸到的內部表面積就越大，從而提供了更多的吸附位點，增加了蛋白的載量?？讖竭^小可能會限制蛋白分子的擴散，導致部分蛋白分子無法接觸到吸附位點，還會增加傳質阻力，使得蛋白分子在填料中的傳遞變得困難，從而降低蛋白載量。而孔徑適中或稍大則有利于蛋白分子的擴散，提高吸附效率，從而增加蛋白載量。蛋白分子的大小與填料孔徑的匹配性也是影響蛋白載量的重要因素。如果蛋白分子過大而孔徑過小，那么蛋白分子可能無法進入孔徑內部，導致吸附效率降低。因此，在選擇填料時，需要考慮蛋白分子的大小與孔徑的匹配性，以確保獲得較高的蛋白載量。

V1:SP 70S Phmac Beads人IgG樣品10%流穿時的體積;

V2: SP 70M Phmac Beads人IgG樣晶10%流穿時的體積;

V3: SP 70L Phmac Beads人IgG樣品10%流穿時的體積;

② 大孔聚合物層析介質用于病毒的分離純化

大孔聚合物層析介質孔徑通透性更好，分子傳質速度快，可大幅度減少蛋白質的失活，有效提高生物大分子的活性回收率和產率。以下為大孔徑Q 70L Phmac Beads層析介質在豬偽狂病毒純化中的數據，結果顯示大孔介質對豬偽狂病毒的分離純化比傳統層析介質具有明顯的優勢。

超大孔 Q 70L Phmac Beads介質對豬偽狂病毒純化色譜圖

Q 70L Phmac Beads和Smac Q 40對豬偽狂病毒純化回收率的比較
（Q 70L Phmac Beads超大孔徑（1000 nm）

層析介質；Smac Q 40：瓊脂糖層析介質）

其他應用方向趨勢

1.該微球具有孔徑大、比表面積高的特點，適合生物大分子的傳質和活性保持，基于本微球材料已經開發了各種表面化學衍生及固定蛋白分子的技術，期望在固定化酶方面進一步推廣應用。2.基于該微球的優良傳質性能和高負載量的特點，可作為催化劑載體，應用于高通量水處理。

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