參考抗體說明書或文獻推薦的起始濃度。若無，可從 0.125 µg/test 到 2-4 µg/test 開始（對于直接標記抗體）。通常設置4-6個梯度。

• 使用與正式實驗相同的樣本類型（如：同種屬的脾細胞、PBMC、細胞系等）。

• 樣本應包含明確的陽性群體和陰性群體（用于計算信噪比）。如果目標抗原表達未知，可用已知陽性和陰性的細胞系或通過刺激/未刺激樣本對比。

• 準備足夠的細胞，每個濃度點至少需要 5×10^5 - 1×10^6 個細胞（考慮設置復孔和對照）。

• 未染色對照：只加細胞，不加抗體。

• 同型對照：與滴定抗體相同物種、亞型、標記物的非特異性抗體，用于設置電壓和評估背景。注意：現代流式更推薦使用熒光減一對照（FMO） 來設門，尤其是在多色實驗中。

示例：滴定小鼠抗人CD3-FITC抗體，建議測試濃度：0.125， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0 µg/test。

① 分配細胞：取5支流式管，每管加入1×10^6個細胞（體積一致，如100µL）。

② 稀釋抗體：將抗體母液按計劃梯度稀釋至工作液濃度，確保每管加入的體積一致（例如10µL），并用緩沖液（如含1% BSA的PBS）補足體積至相同。

③ 孵育：按照標準染色流程（避光、4°C或冰上孵育15-30分鐘）。

④ 洗滌與重懸：加入2-3mL染色緩沖液，離心棄上清，用300-500µL緩沖液或固定液重懸細胞，上機檢測。

⑤ 設置儀器：先用未染色對照調節所有通道的電壓，使陰性群體落在對數坐標軸的10^0-10^1范圍內。此后，所有樣本的電壓保持不變！

1. 獲取數據：記錄每個濃度下陽性群體和陰性群體的平均熒光強度（MFI）。

2. 計算關鍵指標（任選其一，推薦染色指數SI）：

• 信噪比（S/N） = 陽性MFI / 陰性MFI

• 染色指數（SI） = （陽性MFI - 陰性MFI） / （2 × 陰性群體的標準差）

  SI更客觀，因為它考慮了陰性群體的分布寬度。SI值*大時對應的濃度通常是*優濃度。

3. 繪制曲線：以抗體濃度為X軸（對數坐標），SI或S/N為Y軸，繪制曲線。

曲線會先快速上升（抗體不足區），然后進入一個平臺期（*適飽和區），最后可能緩慢下降（抗體過量導致背景增高）。

4. 選擇*適濃度：

• 理想選擇：選擇平臺期起始點或平臺期中段的濃度。例如，如果0.5 µg/test時SI已達平臺期*大值，那么1.0 µg/test并未帶來更好分離，就應選擇0.5 µg/test作為工作濃度。

• 實踐選擇：在平臺期范圍內，有時會選擇比理論*優濃度稍高一點的濃度，以應對樣本間的小幅差異，確保穩定性。

1. 對于CD3、CD4、CD8這類分群明顯且間隔非常開的指標，只做細胞性質確定設門用的時候，可不進行滴定，只滴定那些需要分析比例或MFI的指標。

2. 樣本狀態：確保細胞活性高（>90%），死細胞會增加非特異性染色。考慮使用活死染料。

3. 關于全陽的細胞的滴定，可以在樣本染色后加入未染色的細胞；對于表達量比較少的稀有細胞群體，在染色時，可加入該群細胞的父級細胞群的抗體。

4. 緩沖液：使用含蛋白（如BSA）的染色緩沖液阻斷非特異性結合。

5. Fc受體阻斷：對于表達Fc受體的細胞（如巨噬細胞、B細胞等），務必在染色前進行Fc受體阻斷。

6. 記錄與重復：詳細記錄所有使用的濃度、批號和實驗條件。新批次抗體必須重新滴定，即使貨號相同。

7. 固定：如果需要固定細胞，滴定實驗應在固定后進行，因為固定可能影響熒光強度。

8. 實際實驗過程中在一定的細胞密度范圍內，抗體的染色指數只與抗體的濃度有關，與細胞密度無關。比如染色體系不變，細胞增加10倍，可以不用增加抗體濃度。