流式實驗中樣本制備與保存全流程指南

概述

流式細胞術實驗的樣本制備與保存是實驗成功的關鍵環(huán)節(jié)，其核心原則為保證細胞活性（活細胞分析）、抗原表位完整、細胞懸液單分散無團塊、避免非特異性結(jié)合，根據(jù)不同樣本類型及檢測指標，其保存和制備的方法會有顯著差異，了解并合理保存、制備樣本，也是流式實驗中的一環(huán)。

1. 樣本制備

外周血/骨髓

● 抗凝：使用EDTA或肝素鈉抗凝管收集，避免使用肝素鋰（可能影響后續(xù)某些熒光染料）。

● 紅細胞裂解：通常使用商品化裂解液（如SNR-007 紅細胞裂解液(10x，不含固定劑)），室溫避光裂解3-15分鐘，離心去除紅細胞。注意：裂解后需充分洗滌。

? 注意：如需分析血小板或避免活化，需特殊抗凝和處理流程。

懸浮細胞系

● 直接收集細胞，用預冷的流式染色緩沖液（如含1% BSA的PBS）洗滌。

貼壁細胞系

● 使用不含EDTA的胰酶或細胞刮刀輕柔處理，避免損傷細胞表面抗原。

● 用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，洗滌。

組織樣本

● 機械分散（研磨、剪碎）或酶消化（膠原酶、DNA酶等）制備單細胞懸液。

● 過70μm細胞篩去除團塊，獲得單細胞懸液。

?? 關鍵：處理過程保持低溫，避免細胞死亡和抗原損傷。

石蠟包埋組織

? 需先脫蠟、抗原修復等特殊處理，技術難度較高，非標準流程，有選擇的話一般不建議做這種樣本的流式檢測。

2. 樣本染色

標準染色流程

● 1. 封閉：用含1-5% BSA或血清（與二抗同源）的PBS，冰上封閉10-15分鐘，減少非特異性結(jié)合。

● 2. 抗體染色：

◆ 直接法：加入熒光標記一抗，避光冰浴20-30分鐘。

◆ 間接法：先加一抗，洗滌后再加熒光二抗。

● 3. 洗滌：用預冷流式緩沖液洗滌1-2次，去除未結(jié)合抗體。

? 4. 固定：如需延遲上機，可用1-4%多聚甲醛（PFA）固定，冰上或4℃避光15-20分鐘，然后洗滌。注意：固定后某些熒光蛋白（如GFP）可能淬滅，且部分抗原表位可能被破壞。

● 5. 重懸：用300-500μL流式緩沖液重懸細胞，過35μm細胞篩后上機。

特殊樣本或檢測目標染色

● 胞內(nèi)/核內(nèi)抗原：需先進行表面染色、固定、破膜（用甲醇或商品化破膜劑）、胞內(nèi)染色。

● 細胞因子：通常需先使用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑刺激細胞4-6小時。

● DNA含量分析：用乙醇或甲醇固定后，用PI、7-AAD或DAPI染色。

3. 樣本保存

短期保存（數(shù)小時內(nèi)上機）

● 處理后的樣本置于4℃避光保存，最好在6小時內(nèi)上機。未染色或已染色的單細胞懸液可暫存于4℃。

中期保存（24-72小時）

● 表面抗原：染色后（或染色前）用1-4% PFA固定，4℃避光可保存24-72小時。注意固定時間不宜過長（一般≤24小時為佳），以免影響熒光強度。

● 胞內(nèi)抗原：通常固定破膜后不宜長期保存，應盡快檢測。

長期保存（數(shù)天至數(shù)月）

● 凍存細胞：制備新鮮單細胞懸液，用含10% DMSO的胎牛血清緩慢凍存于程序性凍存盒，-80℃或液氮保存。需要檢測時按復蘇步驟快速解凍，用含DNA酶的培養(yǎng)基洗滌，恢復活性后染色，注意部分抗原可能因凍存受損。

● 固定后凍存：某些研究顯示，PFA固定后的細胞可凍存于-80℃，但可能影響散射光和某些熒光信號。

樣本處理與保存關鍵點

最后，不管是何種樣本處理和保存，最終都需要保證實驗效果，因此需要了解樣本處理和保存需要注意的關鍵點：

? ?保持細胞活性：處理全程在冰上或4℃進行（除非需要活化刺激），使用預冷緩沖液。死細胞會增加非特異性染色，可用死活染料（如PI、7-AAD、Fixable Viability Dyes）排除。

? ? 防止聚集：染色和上機前過細胞篩，保證單細胞懸液質(zhì)量。

? ?對照設置：必須設置未染色對照、單陽對照、同型對照（用于評估非特異性結(jié)合）、FMO對照（用于設門）。

? ?避光操作：從染色開始全程避光，防止熒光淬滅。

? ?抗體優(yōu)化：使用前滴定抗體，確定最佳濃度。

? ?濃度調(diào)整：上機前調(diào)整細胞濃度至10^6-10^7 cells/mL，避免堵塞儀器或信號過弱。

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