小鼠原代主動脈內皮細胞的獲取可通過以下步驟實現，結合酶消化法與差速貼壁技術，可獲得高純度細胞：
 

　　一、實驗準備
 

　　實驗材料
 

　　試劑：磷酸鹽緩沖液(PBS，無鈣鎂)、膠原酶(Type II，0.1%-0.2%)、內皮細胞培養基(如DMEM/F12+20%FBS+1%ECGS+1%青霉素/鏈霉素)、70%乙醇(消毒用)、紅細胞裂解液(可選)。
 

　　儀器：超凈工作臺、CO?培養箱(37℃，5%CO?)、手術器械(眼科剪、鑷子、顯微鑷)、細胞篩(100μm和40μm)、離心機、0.1%明膠包被的培養皿。
 

　　實驗動物
 

　　選用健康成年小鼠(如C57BL/6品系)，通過CO?窒息或頸椎脫臼法處死，并用70%乙醇消毒體表。
 

　　二、主動脈分離與清洗
 

　　暴露主動脈
 

　　沿腹中線剪開胸腔和腹腔，暴露心臟和主動脈。
 

　　用鑷子提起心臟，剪斷主動脈弓，沿胸主動脈向下分離至髂動脈分叉處，完整取出主動脈。
 

　　去除雜質
 

　　將主動脈置于預冷的PBS中，去除周圍脂肪和結締組織。
 

　　縱向剪開主動脈，用PBS沖洗3次以清除血液和細胞碎片。
 

　　三、酶消化與細胞釋放
 

　　膠原酶消化
 

　　將主動脈浸泡于0.1%-0.2%膠原酶溶液中，37℃孵育15-30分鐘，期間輕柔振蕩促進消化。
 

　　消化完成后，加入含血清的培養基終止反應。
 

　　細胞收集
 

　　用移液槍反復吹打主動脈碎片，釋放內皮細胞。
 

　　過100μm和40μm細胞篩去除未消化組織，收集細胞懸液。
 

　　離心(1000rpm，5分鐘)后棄上清，用內皮細胞培養基重懸細胞。
 

　　四、細胞純化與培養
 

　　差速貼壁法
 

　　將細胞懸液接種于未包被的培養皿中，37℃靜置1小時，使成纖維細胞優先貼壁。
 

　　收集未貼壁的內皮細胞，轉移至0.1%明膠包被的培養皿中，提高貼壁率。
 

　　磁珠分選(可選)
 

　　使用CD31或CD144抗體標記內皮細胞，通過磁珠分選進一步提高純度。
 

　　細胞培養
 

　　將純化后的細胞接種于包被的培養皿中，加入內皮細胞培養基。
 

　　置于37℃、5%CO?培養箱中培養，每2-3天換液一次。
 

　　觀察細胞形態，呈“鵝卵石樣”鋪路石狀時表明細胞狀態良好。
 

　　細胞傳代
 

　　當細胞融合度達80%-90%時，用0.25%胰酶消化傳代，按1:2或1:3比例接種。
 

　　原代內皮細胞傳代次數建議不超過5代，以防表型丟失。
 

　　五、關鍵注意事項
 

　　無菌操作：所有步驟需在超凈工作臺內進行，避免污染。
 

　　消化時間控制：膠原酶消化時間過長可能導致細胞損傷，需優化實驗條件。
 

　　細胞鑒定：通過免疫熒光檢測CD31、vWF或eNOS等內皮標志物確認細胞純度(純度應高于90%)。
 

　　避免過度傳代：原代內皮細胞傳代次數有限，過度傳代可能導致功能喪失。