步驟

材料

緩沖液和溶液

貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1, 將貯存液稀釋到合適的濃度。

5XBAL31 緩沖液
2.5mol/LNaCl
62.5 mmol/LCaCl2
62.5 mmol/LMgCl2
100 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
有 4 種 dNTP 的溶液，每種濃度為 0.5 mmol/L

EGTA(0.5mol/L,pH8.0)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

醋酸鈉（3mol/L，pH5.2)

蔗糖凝膠上樣緩沖液

TE(pH7.6)

酶和緩沖液

噬菌體 T4DNA 聚合酶

BAL31 核酸酶

大腸桿菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段

限制性內切酶
請見步驟 3、23 和 31。

凝膠

瓊脂糖凝膠
請見步驟 3 和 32。

含 0.5ug/ml 溴化乙錠的瓊脂糖凝膠（0.8%)
請見步驟 11。

用 TBE 配制的含 0.5ug/ml 溴化乙錠的瓊脂糖凝膠
請見歩驟 25。

制備瓊脂糖凝膠
請見步驟 27。

核酸和寡核苷酸

用于凝膠電泳的 DNA 分子量標準

專用設備

計時鐘

65°C 水浴和適合限制性內切核酸酶消化溫度的水浴

其他試劑

本方案步驟 1 需要的試劑列在第 1 章方案 17~19 或第 3 章方案 6 中。
本方案步驟 2 需要的試劑列在第 1 章方案 9 中。
本方案步驟 27 需要的試劑列在第 5 章方案 4、5、6 或 7 中。
本方案步驟 30 需要的試劑列在第 1 聿方案 23~26 或第 3 章方案 6 或 8 中。
本方案步驟 31 需要的試劑列在第 1 章方案 1 或第 3 章方案 3 中。
本方案步驟 34 需要的試劑列在第 12 章方案 3、4、5 中。

方法

制備用于 BLA31 消化的靶 DNA

1. 將靶 DNA 片段克隆進合適的質粒或噬菌體 M13 載體。
如果擬從靶 DNA 的兩個末端同時構建缺失突變體，需要選擇有多克隆位點的適當載體將靶 DNA 從兩個方向克隆進載體。

2. 用 Qiagen 層析柱（或相當的產品）和乙醇沉淀純化閉合環狀重鉭 DNA。把 DNA 重新溶解在最小體積的 Tris/EDTA 溶液中。
使用高純度的閉合環狀 DNA 是很重要的，（i) 降低反應中污染的 RNA 和大腸桿菌染色體 DNA 小片段在總末端濃度中的比例；（ii）刪除能夠被 BAL31 降解的帶缺口的環狀 DNA。

3. 用切割位點位于靶 DNA—端的限制酶*消化 30ug 閉合環狀 DNA。界定該位點為嵌套缺失起始的共同點。瓊脂糖凝膠電泳驗證限制酶消化*。

4. 等體積的酚: 氯仿抽提純化 DNA。在微型離心機上以最大離心速度離心 3 min 分離有機相和水相，將水相轉移到一個新的微量離心管中。

5. 加入 0.1 倍體積的 3mol/L 醋酸鈉（PH5.2) 和 2 倍體積冰上預冷的乙醇。在 O°C 溫度下放置 10 min, 在微型離心機上以最大轉速 4°C 離心 10 min 收獲 DNA。

6. 除去上清，用 70% 的乙醇室溫下小心漂洗 DNA 沉淀物。室溫下干燥 DNA 沉淀物，用 TE(pH7.6) 緩沖液溶解 DNA 沉淀物使之達到 lug/ul 的余度。在-20°C 條件下貯存 DNA。

BAL31 活性分析

大多數商業化的 BAL31 酶制品含有兩種動力學上截然不同的酶活性形式：快形式和慢形式（請見信息欄關于 BAL31)。慢形式是快形式的蛋白水解降解產物。BAL31 消化 DNA 的速率是所用特定酶制劑中快形式與慢形式比例的函數。目前能夠得到純化的快速酶制劑（Weietal.1983), 但很昂貴，而且在貯存過程中經常衰變成慢形式。為了使 BAL31 保持在快形式狀態，不應將酶冷凍而要貯存于 4°C。
由于 BAL31 中快、慢形式的比例因制劑而異，因此必須按以下步驟測定用于構建缺失體的特定批次的酶活性。

7. 在微量離心管中混合：

線狀 DNA(1ug/ul)                                    4ul
水                                                               48ul
5XBAL31 緩沖液                                     13ul
按的量將以上混合物分配到 7 個微量離心管中。

8. 用 1XBAL31 緩沖液把 BAL31 進行 7 次 2 倍稀釋，最好按以下方法稀釋，將 7 滴（2ul)1XBAL31 緩沖液點在置于冰床或冰冷的金屬塊上的石蠟膜表面上，用一次性微量移液器吸頭吸取 2ul 待實驗的 BAL31 酶與第一滴 BAL31 緩沖液混合。換一個新的吸頭吸取 2ul 上述 BAL31 和緩沖液的混合物轉移至第二滴 BAL31 緩沖液中，再度混合均勻。如此類推，直到所有的 BAL31 緩沖液均已與酶混合。迅速地從后 6 份混合液中分別取出 1 至 6 個含線狀 DNA 的微量離心管中，第 7 個反應管中不要加酶。
大多數商業化 BAL31 酶制劑的濃度大約為 1 單位/ul;0.05~0.1 單位的 BAL31 酶足以將 1ug 長度為 2kb 的線狀 DNA 分子消化成長度小于 200bp 的片段。

9. 將所有微量離心管（包括不加酶的管）在 30°C 孵育 30 min。

10. 每個反應管中加入 1ul200 mmol/LEGTA(pH8.0), 然后于 65°C 加熱 5 min。
BAL31 反應需要 Ca2+, 酶活性可以被 EGTA *抑制。65°C 加熱 5 min 也可以使該酶滅活。

11. 以上每份樣品與 3ul 瓊脂糖凝膠上樣緩沖液混合，在含 0.5ug/ml 溴化乙錠 (0.8%) 的瓊脂糖凝膠上電泳，分析 DNA 的大小。

12. 在紫外燈照射下檢査凝膠，并決定合適的酶稀釋度，即剛好使 DNA 得到適度的消化，以至只檢測到彌散的小片段 DNA(200bp)。該稀釋度將被用于大規模消化反應（步驟 15)。
另一種檢査 BAL31 消化程度的方法是設 SBAL31 大量消化反應，在不同的時間點上取樣。用限制性內切核酸酶消化毎一份樣品，限制酶應能切割靶片段數次。隨著 BAL31 消化過程的進展，限制酶片段以一定的次序消失。從限制酶片段的大小位置，便能估計出 BAL31 的消化速率。大量消化反應中使用的 BAL31 量應在反應開始后的前 5 min 內足以使靶片段的長度減少 20%。

用 BAL31 進行大量消化

13. 混合

線狀 DNA(1ug/ul)                           20ul
水                                                      240ul
5XBAL31 緩沖液                            65ul
30°C 水浴中孵育以上混合物。

14.30°C 孵育期間，準備 8 個微量離心管，每管中含有 5ul 200 mmol/LEGTA(pH8.0)，將離心管標記為 1.5 min、3 min、4.5 min 等時間段。

15. 將 36ul 稀釋的 BAL31(請見步驟 12) 加入到步驟 13 反應混合物中，輕敲離心管壁，將內容物快速混合均勻后放回到 30°C 水浴中，開始計時。

16. 每隔 1.5 min 將 45ul 反應混合物轉移到帶相應標記的微量離心管中，將離心管置于冰上，直到所有樣品收集完畢。

17.65°C 加熱 5 min 滅活 BAL31 酶。

18. 每管中加入 5ul 3 ml/L 的醋酸鈉（PH5.2), 再加入 100ul 冰冷的乙醇，振蕩混合溶液，將離心管放置在冰上 20~30 min。

19. 最大轉速 4°C 離心回收 DNA, 除去上清，用 200ul 冰冷的 70% 的乙醇洗滌沉淀物，再離心 2 min。

20. 仔細的去除上清，將敞開管蓋的離心管直立放置在室溫，直到所有的乙醇揮發殆盡。將每份沉淀物溶解在 23ulTE(pH7.6) 中。

分離截短的靶片段

21. 每份 DNA 制備物中加人：

0.5 mmol/LdNTP 溶液                                       3ul
10X 聚合酶緩沖液                                               3ul
噬菌體 T4DNA 聚合酶（約 5 單位）               1ul

室溫下反應 15 min, 然后加入 1(約 5 單位）的 Klenow 片段。繼續在室溫下孵育 15 min。
在修復反應中使用兩種不同的 DNA 聚合酶，可使突變體的回收率增加近三倍。

22. 用酚: 氯仿抽提純化 DNA, 按步驟 18~20 所描述的過程用乙醇沉淀 DNA。將每份 DNA 溶解在 16ulTE(pH7.6) 中。

23. 在毎一份 DNA 中加入 2ul 相應的 10x 限制酶緩沖液和 8 單位的可使靶 DNA 和載體分開的限制酶，在適當的溫度下孵育反應 1h。

24. 在孵育結束時，從每一個消化反應中取出 3ul 轉移至一個新的微量離心管中，剩余的消化反應放置在冰上以備步驟 27 使用。

25. 每 3ul 上述反應液中加入 1ul 蔗糖凝膠上樣緩沖液混合，將樣品加到含有 0.5ug/ml 溴化乙錠和 0.5XTBE 的瓊脂糖凝膠加樣孔中。凝膠邊上的加樣孔內應加入一個適當大小的分子量標準參照物。
灌制的瓊脂糖凝膠的濃度應適合分離靶片段和栽體（請見第 5 章導言部分的表 5-2)。

26. 利用凝膠電泳分離靶片段和載體 DNA, 在紫外光照射下觀察凝膠，并決定哪份樣品已被 BAL31 消化至合適的大小。

27. 合并含合適大小靶 DNA 的質粒樣品，按第 5 章方案 4~7 描述的方法通過制備凝膠分離并回收靶 DNA 片段。

28. 根據溴化乙錠產生的熒光強度，估計出所純化的靶 DNA 量。

克隆缺失的靶片段

29. 用質粒、噬菌粒或噬菌體 M13 載體（見第 1 或第 3 章）與缺失的粑片段連接。載體應攜帶一個鈍端和一個與步驟 23 使用的內切酶相匹配的末端。
連接反應的確切成分和體積取決于靶 DNA 的量，如果可能，應使用 50ng 或 100ng 靶 DNA。保證載體 DNA 對靶 DNA 的摩爾比至少為 5(以便最大限度地減少含有一個以上靶 DNA 片段重組子的數量)。為了最大限度地形成重組體，連接反應應在適于鈍端連接的條件下進行，例如在高濃度的噬菌體 T4DNA 連接酶、聚乙二醇和低濃度 ATP 的小反應體積中進行。有關連接條件的詳細情況，請見第 1 章方案 19。

30. 用小量的或稀釋的連接混合物轉化（質粒或噬菌粒）或轉染（噬菌體 M13 復制型 DNA) 合適的大腸桿菌感受態菌株。第二天隨機挑選 12 個轉化菌落或噬菌體 M13

噬斑進行少量培養。

31. 采用第 1 章或第 3 章描述的方法之一從 12 個培養物中純化質粒、噬菌粒或噬菌體 M13 復制形式 DNA。用可從載體中切出靶片段的限制酶消化 DNA。

32. 通過凝膠電泳和大小合適的 DNA 分子量標準參照物分析從每種 DNA 中切出的靶片段的大小。

33. 如果結果是滿意的（例如靶片段的大小在希望的范圍內），可大量挑取相互獨立的轉化單菌落或噬斑。按上述方法鑒定插入片段的大小。保留攜帶大小符合的重組子培養物。

34. 通過 DNA 測序確定每種突變體缺失位點的準確部位（請見第 12 章方案 3、4 或 5)。