熒光成像 失敗事例與成功訣竅

熒光顯微鏡的使用需要很多專業(yè)技術，若要全部掌握需要花費大量的時間。但是，只要掌握觀察時的基本拍攝方法及基礎性的要點，即使不熟悉熒光顯微鏡原理，也能夠獲得準確的實驗數(shù)據(jù)。下面，基于熒光成像中容易陷入失敗的案例，總結在短時間內高效拍攝的要點。

■何謂熒光成像

熒光成像（Fluorescence imaging）是指，對無法直接觀察的無色透明的細胞器官或特定蛋白質，通過熒光標記試劑或熒光抗體進行熒光標記從而實現(xiàn)可視化的手法，由此能夠對細胞或蛋白質的形態(tài)或結構、生命活動進行觀察與分析。
熒光試劑或抗體經(jīng)過特定波長光（激發(fā)光）的照射后具有發(fā)光特性，通過熒光顯微鏡或激光共焦顯微鏡進行觀察。
從可進行活細胞的實時觀察到分子級別或細胞級別各種各樣的實驗，大量的生物實驗均基于熒光顯微鏡的使用。另一方面，使用熒光顯微鏡進行分析或評價的結果會因選擇的相機、物鏡以及光源等的不同而產生差異。

■熒光成像失敗事例1：對焦失敗

對焦是顯微鏡的重要的基本操作。通過觀察準確的焦平面圖像才能進行準確的實驗評價，圖像（Figure）的品質有時甚至左右論文能否受到認可。首先，說明拍攝對焦準確的清晰圖像拍攝的要點。

?要點1：確認使用的物鏡是否合適

要進行顯微鏡觀察必須了解觀察目的與物鏡特性是否相符。尤其在熒光觀察中重要的是數(shù)值孔徑（NA），數(shù)值孔徑越大，越能獲取明亮，正常情況下，數(shù)值孔徑越大分辨率也越高，可獲取精細的圖像，但在另一方面，景深（Depth of Field：DOF）則變淺，被攝物體的可視對焦范圍變窄。除此以外，物鏡亮度或觀察距離也需要考慮，這些特性間的相關關系如下圖所示。

一般物鏡特性

另外還有需要蓋板玻璃校正*1及校正環(huán)調整*2的物鏡、專用于特殊觀察方法的光學設計物鏡等各種各具特點的物鏡*3。根據(jù)觀察方法選擇合適的物鏡尤為重要。

*1 蓋板玻璃校正：
蓋板玻璃校正物鏡設有蓋板玻璃校正值。正常情況下，蓋板玻璃使用0.17 mm，塑料培養(yǎng)皿為1.2 mm，不使用蓋板玻璃時使用0 mm物鏡。

*2 校正環(huán)調整：
高倍率物鏡中還有外殼部分帶有校正環(huán)（類似表盤）的部件。根據(jù)蓋板玻璃的厚度調整校正環(huán)，分辨率可變化數(shù)倍，使用前請務必確認校正環(huán)的狀態(tài)。

*3 物鏡的特點：
按照觀察方法，有時需要符合觀察方法的特定光學設計物鏡。包括相差、微分干涉、偏光、熒光、油鏡等。請確認物鏡種類。

?要點2：從低倍率向高倍率調整物鏡

為了高效地找到目標，必須先使用大視野低倍率物鏡尋找目標，在確定一定的目標范圍后再提高倍率觀察。

?要點3：由近及遠查找焦點位置

不具備防撞機構的顯微鏡有可能導致物鏡碰到樣品。尋找焦點時，請先將物鏡靠近樣品，然后逐漸遠離。

■如果是基恩士的熒光顯微成像系統(tǒng) 則無需對焦。“超高速自動對焦"

如果是基恩士的一體化熒光顯微成像系統(tǒng)BZ-X，單擊一下畫面即可切換至高靈敏度局部掃描模式*，高速掃描Z軸方向。除了明視場、相位差以外，即便是光量較弱的熒光圖像，不論倍率如何，只需數(shù)秒即可瞬間進行對焦，連操作不習慣的人也可輕松獲取清晰圖像。

* 高靈敏度局部掃描模式：
通過組合使用Binning（像素融合）處理和CCD的局部讀取，使BZ-X的高靈敏度黑白制冷CCD具備更高靈敏度的模式。能高速讀取通常需要較長曝光時間的微弱熒光圖像，快速地而且準確地進行感測。此外，還可通過專屬的對焦控制馬達高精度地控制Z軸。不熟悉顯微鏡操作的人也可正確對焦。

切實實現(xiàn)熒光成像的熒光顯微成像系統(tǒng)

■熒光成像失敗事例2：熒光信號過暗，對比度不足

在熒光成像中重要的是獲取目標熒光分子或熒光蛋白質的信號清晰可見的圖像。為此，重要的不僅是物鏡，還有與相機或濾光片、光源等各種單元的組合，如果組合構成失敗，會使圖像的熒光信號過暗、對比度過低，從而難以觀察。下面，說明獲取清晰圖像所需掌握的要點。

?要點1：使用適合觀察的相機

相機也有很多種類，下面介紹廣泛用于熒光顯微鏡的CCD相機的特點。
熒光觀察中重要的是S/N比（信號與干擾的比率）足夠高，因此在下表中合適的是黑白制冷CCD相機。

*1 可見光：
一般是指波長大約為400至700 nm的光。彩色相機的顯示與人眼相同，會切斷波長長度700 nm以上的光。因此無法觀察。

*2 暗電流和制冷：
CCD相機內部在沒有輸入光的狀態(tài)下也會產生叫作“暗電流"的信號，是造成干擾的原因。曝光時間越長受光元件的溫度越高，干擾也變大，通過冷卻相機可抑制干擾。

?要點2：使用調節(jié)亮度功能

亮度調節(jié)功能有多種，在相機設定中主要的調節(jié)方式是以下3個項目。理解這些特點并熟練地區(qū)分使用對熒光成像非常重要。

曝光時間

快門處于開啟的時間。為在此期間積蓄信號，曝光時間越長亮度越高，同時暗電流干擾也會累積從而干擾增多。

增益

對輸入CCD元件的電信號進行電性放大。但是，放大輸入信號后，干擾也會同時被放大。分辨率不因增益值而變化。

Binning（像素融合）

將臨近的像素視為1個假想像素，提高每個單位像素的接收信號量的功能。由于像素被合并圖片整體的像素數(shù)減少，分辨率將下降，但不會增加干擾。

?要點3：熒光濾光片與試劑的匹配

即使熒光信號明亮而發(fā)光，如果濾光片透過率過低，仍無法充分觀察信號。重要的是盡量使用透過率高的濾光片。
熒光濾光片由激發(fā)濾光片與吸收濾光片、二向色鏡共3部分組成。確認激發(fā)濾光片是否與試劑的激發(fā)光譜重疊，吸收濾光片是否與試劑的熒光光譜重疊。假設加入濾光片上標注470/40時，表示可涵蓋470nm±20nm的波長范圍。數(shù)值數(shù)據(jù)難以理解時，觀察試劑與濾光片的光譜數(shù)據(jù)來判斷是否匹配。各種試劑或濾光片的光譜數(shù)據(jù)可通過各廠商的網(wǎng)站等確認。

?要點4：物鏡的選擇

熒光信號偏弱，或對比度不足時，可通過更換NA值更大的物鏡，以便更明亮地觀察。 NA值越大，越能夠明亮地觀察熒光信號。物鏡的倍率越高，NA值也趨于變大，S/N比的上升不夠理想時，通過使用倍率更高的物鏡也可解決問題。

?要點5：光源的選擇

有些光源沒有發(fā)出要觀察的波長。需要確認使用的光源，了解光源的特點并區(qū)分使用。
相比于水銀燈或金鹵燈是1種光源包含短波長到長波長的大范圍波長，激光或LED是1種光源只發(fā)出特定范圍的波長，因此需要將多個光源組合使用。信號無法順利發(fā)光時，確認試劑與光源波長的光譜數(shù)據(jù)。

■如果是基恩士的熒光顯微成像系統(tǒng)

可清晰地捕捉各種標本。“無妥協(xié)的一體化設計"

基恩士的一體化熒光顯微成像系統(tǒng)BZ-X在部件上都不妥協(xié)。
高靈敏度黑白制冷CCD相機，可利用帕爾帖元件冷卻至環(huán)境溫度-25°C，實現(xiàn)干擾較少的高靈敏度拍攝。
熒光光源搭載了金鹵燈，可在350 nm以下短波長帶到700 nm以上長波長帶的大范圍波長帶進行觀察。而且，熒光濾光片采用透過率高的硬涂層型濾光片，通過組合使用NA值大的物鏡，能夠明亮清晰地觀察正常情況下由于太暗而難以觀察的適合于ICG或Cy7等活細胞成像的近紅外區(qū)域（生物組織光學窗口）。

切實實現(xiàn)熒光成像的熒光顯微成像系統(tǒng)

■熒光成像失敗事例3：熒光發(fā)生淬滅，細胞活性下降

發(fā)生淬滅或細胞活性下降的原因大多在于激發(fā)光導致的損傷。即使是瞬間，只要照射強烈的激發(fā)光，就會出現(xiàn)淬滅現(xiàn)象，細胞也會因光毒性影響而導致活性下降。為了防止此類現(xiàn)象，首先需要盡量“降低激發(fā)光強度"。但是，即使降低了激發(fā)光的強度，若長時間照射激發(fā)光，熒光信號仍會衰減直至淬滅，細胞將逐漸累積損傷最終失去活性。因此，降低激發(fā)光強度的同時，“縮短激發(fā)光照射時間"是防止激發(fā)光對實驗影響的重要兩點。

?要點1：激發(fā)光強度下降

降低激發(fā)光強度，熒光就會相應地變暗，因此需要提高相機增益或延長曝光時間。但是，提高增益或延長曝光時間，就會增大暗電流的干擾，S/N比變低。
要在抑制淬滅及損傷的同時拍攝S/N比高的圖像，需要盡量使用靈敏度高的相機。

?要點2：縮短激發(fā)光照射時間

要縮短激發(fā)光照射時間，需要降低基本的操作時間，因此盡量縮短對焦時間、信號查找所用的時間、設定曝光時間所用的時間等操作所用的時間。
另外，對于手動控制激發(fā)光快門開閉的顯微鏡類型，可能發(fā)生忘記關快門而造成長時間持續(xù)照射激發(fā)光，導致淬滅。因此拍攝結束后或臨時停止觀察時，及時關閉快門尤為重要。

■如果是基恩士的熒光顯微成像系統(tǒng)

驚人的不易淬滅。獲得認可的“淬滅減輕模式"

基恩士的一體化熒光顯微成像系統(tǒng)BZ-X通過像閃光燈那樣只在必要的瞬間照射激發(fā)光的淬滅減輕模式，最高可將激發(fā)光照射時間縮短至微秒級別。由此能夠顯著減輕淬滅及損傷。

切實實現(xiàn)熒光成像的熒光顯微成像系統(tǒng)

基恩士 一體化熒光顯微成像系統(tǒng) BZ-X1000系列，

在醫(yī)學與生命科學等領域應用廣泛。

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