一、引言

二、電穿孔技術(shù)原理及流程

（一）原理

（二）流程

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

• 選擇合適的細(xì)胞類型：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅x取具有特定生物學(xué)特性的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、細(xì)胞系等。

• 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞接種于適宜的培養(yǎng)基中，在合適的溫度、濕度和氣體環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，使其處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)并達(dá)到一定的細(xì)胞密度。通常在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行電穿孔操作，此時(shí)細(xì)胞活性較高，對(duì)電穿孔的耐受性相對(duì)較好。

• 收集細(xì)胞：用胰蛋白酶等消化酶將細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面分離下來(lái)，然后通過(guò)離心等方法收集細(xì)胞沉淀，并用適當(dāng)?shù)木彌_液（如磷酸鹽緩沖液 PBS）洗滌細(xì)胞，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和血清成分，避免其對(duì)電穿孔過(guò)程產(chǎn)生干擾。

2. 電穿孔緩沖液配制

• 選擇合適的緩沖液成分：電穿孔緩沖液的主要作用是維持細(xì)胞的滲透壓和離子平衡，同時(shí)提供適宜的離子環(huán)境以促進(jìn)電穿孔的發(fā)生。常用的緩沖液成分包括無(wú)機(jī)鹽（如 NaCl、KCl 等）、糖類（如葡萄糖）和緩沖劑（如 Hepes 等）。根據(jù)不同的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求，可以對(duì)緩沖液的成分和濃度進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。

• 調(diào)整 pH 值和滲透壓：將緩沖液的 pH 值調(diào)節(jié)至與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相近的范圍（一般為 7.2 - 7.4），以保證細(xì)胞在緩沖液中的活性和穩(wěn)定性。同時(shí)，通過(guò)添加適量的溶質(zhì)來(lái)調(diào)整緩沖液的滲透壓，使其與細(xì)胞內(nèi)液滲透壓相當(dāng)，防止細(xì)胞在電穿孔過(guò)程中因滲透壓變化而受到損傷。例如，對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，緩沖液的滲透壓可調(diào)整在 280 - 320 mOsm/kg 之間。

• 過(guò)濾除菌：將配制好的電穿孔緩沖液通過(guò) 0.22 µm 或 0.45 µm 的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，以去除緩沖液中的細(xì)菌和其他微生物污染物，確保電穿孔過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

3. 電穿孔儀參數(shù)設(shè)置

• 電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度是電穿孔過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)之一，它直接影響電穿孔的效果和細(xì)胞的存活率。電場(chǎng)強(qiáng)度的選擇應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型、細(xì)胞大小、緩沖液成分以及外源物質(zhì)的性質(zhì)等因素進(jìn)行優(yōu)化。一般來(lái)說(shuō)，較小的細(xì)胞和較低濃度的外源物質(zhì)需要較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而較大的細(xì)胞和較高濃度的外源物質(zhì)則需要相對(duì)較低的電場(chǎng)強(qiáng)度。電場(chǎng)強(qiáng)度的單位通常為伏特 / 厘米（V/cm），其取值范圍在幾百到幾千 V/cm 之間。對(duì)于常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，電場(chǎng)強(qiáng)度一般在 500 - 1500 V/cm 之間。

• 脈沖寬度：脈沖寬度是指電場(chǎng)作用于細(xì)胞的時(shí)間長(zhǎng)度，它也對(duì)電穿孔效果有重要影響。較長(zhǎng)的脈沖寬度可以增加孔隙的形成和維持時(shí)間，有利于外源物質(zhì)的進(jìn)入，但同時(shí)也會(huì)增加細(xì)胞的損傷風(fēng)險(xiǎn)；較短的脈沖寬度則可能導(dǎo)致孔隙形成不完整，影響電穿孔效率。脈沖寬度的單位通常為微秒（µs）或毫秒（ms），其取值范圍在幾個(gè)微秒到幾十毫秒之間。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，脈沖寬度在 10 - 50 µs 之間較為合適。

• 脈沖次數(shù)：脈沖次數(shù)是指電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞施加脈沖的次數(shù)。增加脈沖次數(shù)可以提高電穿孔效率，但也會(huì)進(jìn)一步增加細(xì)胞的損傷程度。因此，脈沖次數(shù)的選擇需要在電穿孔效率和細(xì)胞存活率之間進(jìn)行平衡。一般情況下，脈沖次數(shù)在 1 - 5 次之間較為常見(jiàn)。

• 設(shè)置電擊杯類型：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的電擊杯，電擊杯的尺寸和形狀會(huì)影響電場(chǎng)的分布和細(xì)胞的排列方式。常見(jiàn)的電擊杯有不同的容量（如 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL 等）和電極間距，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和電穿孔儀的要求進(jìn)行選擇。

4. 電穿孔操作

• 將細(xì)胞懸浮于電穿孔緩沖液中：將收集并洗滌好的細(xì)胞沉淀重新懸浮于適量的電穿孔緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適的范圍（一般為 1×10? - 1×10? 個(gè) /mL）。細(xì)胞濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞之間相互作用增強(qiáng)，影響電場(chǎng)分布和電穿孔效果；細(xì)胞濃度過(guò)低則會(huì)浪費(fèi)外源物質(zhì)和實(shí)驗(yàn)資源。

• 加入外源物質(zhì)：將需要導(dǎo)入細(xì)胞的外源物質(zhì)（如 DNA 質(zhì)粒、RNA 分子、蛋白質(zhì)等）加入到細(xì)胞懸浮液中，輕輕混勻。外源物質(zhì)的加入量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，過(guò)多的外源物質(zhì)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而過(guò)少則可能無(wú)法達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。

• 將細(xì)胞 - 外源物質(zhì)混合液轉(zhuǎn)移至電擊杯：使用移液器將細(xì)胞 - 外源物質(zhì)混合液小心地轉(zhuǎn)移至預(yù)先冷卻的電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡。確保混合液均勻分布在電擊杯的電極之間，以保證電場(chǎng)能夠均勻作用于細(xì)胞。

• 進(jìn)行電穿孔操作：將電擊杯正確插入電穿孔儀的插槽中，按照設(shè)定好的參數(shù)啟動(dòng)電穿孔儀進(jìn)行電擊操作。在電擊過(guò)程中，應(yīng)密切觀察電穿孔儀的運(yùn)行狀態(tài)和電擊杯中的細(xì)胞情況，確保操作順利進(jìn)行。

• 電穿孔后處理：電擊完成后，立即將電擊杯從電穿孔儀中取出，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的含有適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中（如培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等）。將培養(yǎng)容器放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在合適的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)導(dǎo)入的外源物質(zhì)。在培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和存活情況，并根據(jù)需要進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析和檢測(cè)。

三、電融合技術(shù)原理及流程

（一）原理

（二）流程

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

• 細(xì)胞來(lái)源和類型選擇：與電穿孔技術(shù)類似，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞來(lái)源和類型。例如，在進(jìn)行體細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以選取來(lái)自同一組織或器官的不同類型的體細(xì)胞；在進(jìn)行細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，則需要選擇具有不同遺傳特性的兩種細(xì)胞進(jìn)行融合。

• 細(xì)胞培養(yǎng)和處理：對(duì)選取的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和適宜的細(xì)胞密度。在進(jìn)行電融合操作前，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚蕴岣呒?xì)胞的融合效率。例如，可以使用胰蛋白酶等消化酶將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，并通過(guò)離心和洗滌等步驟去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基成分。此外，還可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，如用某些化學(xué)試劑（如聚乙二醇 PEG）或生物因子（如仙臺(tái)病毒）處理細(xì)胞，使細(xì)胞的細(xì)胞膜變得更加柔軟和易于融合。

2. 電融合緩沖液配制

• 緩沖液成分選擇：電融合緩沖液的成分與電穿孔緩沖液類似，但通常需要根據(jù)細(xì)胞融合的特點(diǎn)進(jìn)行一些調(diào)整。除了包含維持細(xì)胞滲透壓和離子平衡的無(wú)機(jī)鹽、糖類和緩沖劑外，還可以添加一些有助于細(xì)胞融合的成分，如鈣離子（Ca2?）等。鈣離子可以促進(jìn)細(xì)胞膜的融合過(guò)程，提高融合效率。

• pH 值和滲透壓調(diào)節(jié)：將電融合緩沖液的 pH 值調(diào)節(jié)至適宜的范圍（一般為 7.0 - 7.4），以保證細(xì)胞在緩沖液中的活性和穩(wěn)定性。同時(shí)，調(diào)整滲透壓使其與細(xì)胞內(nèi)液滲透壓相近，通常在 280 - 320 mOsm/kg 之間。

• 過(guò)濾除菌：采用與電穿孔緩沖液相同的方法對(duì)電融合緩沖液進(jìn)行過(guò)濾除菌，確保緩沖液的無(wú)菌性。

3. 電融合儀參數(shù)設(shè)置

• 交流電場(chǎng)參數(shù)：在電融合過(guò)程中，首先需要施加一個(gè)交流電場(chǎng)，其作用是使細(xì)胞在電場(chǎng)中排列成串，并促進(jìn)細(xì)胞之間的緊密接觸。交流電場(chǎng)的參數(shù)包括電壓、頻率和作用時(shí)間。電壓的選擇應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和大小進(jìn)行調(diào)整，一般在幾十伏到幾百伏之間。頻率通常在幾百赫茲到幾千赫茲之間，作用時(shí)間為幾十秒到幾分鐘不等。較高的電壓和頻率可以使細(xì)胞更快地排列成串，但也可能對(duì)細(xì)胞造成損傷；較低的電壓和頻率則需要較長(zhǎng)的作用時(shí)間，但細(xì)胞的存活率相對(duì)較高。因此，需要在實(shí)驗(yàn)中對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以找到適合的條件。

• 直流脈沖電場(chǎng)參數(shù)：在細(xì)胞排列成串并緊密接觸后，需要施加一個(gè)直流脈沖電場(chǎng)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞膜的融合。直流脈沖電場(chǎng)的參數(shù)主要包括電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖寬度和脈沖次數(shù)。電場(chǎng)強(qiáng)度一般在幾百伏 / 厘米到幾千伏 / 厘米之間，脈沖寬度在幾十微秒到幾百微秒之間，脈沖次數(shù)通常為 1 - 3 次。這些參數(shù)的選擇也需要根據(jù)細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行優(yōu)化，以獲得較高的融合效率和細(xì)胞存活率。

4. 電融合操作

• 將細(xì)胞懸浮于電融合緩沖液中：將經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞以適當(dāng)?shù)臐舛葢腋∮陔娙诤暇彌_液中，細(xì)胞濃度一般為 1×10? - 1×10? 個(gè) /mL。確保細(xì)胞懸浮液均勻，避免細(xì)胞團(tuán)聚。

• 將細(xì)胞懸浮液加入電融合室：使用移液器將細(xì)胞懸浮液小心地加入到電融合室中，電融合室通常是一個(gè)具有特殊電極結(jié)構(gòu)的容器，可以在電場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的排列和融合。加入細(xì)胞懸浮液時(shí)應(yīng)注意避免產(chǎn)生氣泡，以免影響電場(chǎng)分布和細(xì)胞融合效果。

• 施加交流電場(chǎng)：?jiǎn)?dòng)電融合儀，按照設(shè)定好的交流電場(chǎng)參數(shù)施加交流電場(chǎng)。在交流電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞會(huì)逐漸排列成串，并相互緊密接觸。觀察細(xì)胞在電融合室中的排列情況，確保細(xì)胞排列均勻且緊密接觸。如果細(xì)胞排列不理想，可以適當(dāng)調(diào)整電場(chǎng)參數(shù)或重新進(jìn)行操作。

• 施加直流脈沖電場(chǎng)：當(dāng)細(xì)胞排列成串并緊密接觸后，切換到直流脈沖電場(chǎng)模式，按照設(shè)定好的參數(shù)施加直流脈沖電場(chǎng)。在直流脈沖電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生融合，形成融合細(xì)胞。在施加直流脈沖電場(chǎng)過(guò)程中，應(yīng)密切觀察細(xì)胞的融合情況和電融合儀的運(yùn)行狀態(tài)，確保操作順利進(jìn)行。

• 融合后處理：電融合操作完成后，將融合細(xì)胞從電融合室中取出，轉(zhuǎn)移至含有適宜培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件應(yīng)根據(jù)融合細(xì)胞的類型和特性進(jìn)行調(diào)整，以促進(jìn)融合細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在培養(yǎng)過(guò)程中，需要定期觀察融合細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和融合效果，并進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析和檢測(cè)，如融合細(xì)胞的形態(tài)觀察、染色體分析、基因表達(dá)檢測(cè)等，以評(píng)估電融合技術(shù)的效果和融合細(xì)胞的生物學(xué)特性。

四、結(jié)論