一、準備工作

 

　　開始前，請確保以下材料和試劑已備齊：納米抗體偶聯beads、平衡緩沖液（如PBS，pH7.4）、洗脫緩沖液（如0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7）、中和液（如1MTris-HCl，pH8.5），以及待純化的樣品。建議將所有緩沖液提前過濾除雜，并置于4℃預冷。

 

　　二、操作步驟

 

　　1.beads平衡

 

　　取適量納米抗體beads（根據目標蛋白量而定，一般1mLbeads可捕獲5-10mg蛋白）加入層析柱或離心管中。用5倍柱體積的平衡緩沖液清洗beads兩次，以去除存儲液中的防腐劑。輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩破壞beads結構。

 

　　2.樣品孵育

 

　　將預處理好的樣品（建議離心澄清并用0.45μm濾膜過濾）加入到平衡后的beads中。室溫下旋轉孵育30-60分鐘，或4℃孵育2小時（對于易降解蛋白更友好）。孵育期間保持beads懸浮，確保納米抗體與目標蛋白充分結合。

 

　　3.洗滌去雜

 

　　孵育結束后，低速離心（500-1000g，1分鐘）或自然沉降beads，棄上清。用10倍柱體積的洗滌緩沖液（可含少量Tween-20，如0.05%）分3-4次洗滌beads，每次顛倒混勻后離心去上清。這一步可有效去除未結合的雜蛋白和非特異性吸附。

 

　　4.目標蛋白洗脫

 

　　向洗凈的beads中加入1-2倍柱體積的洗脫緩沖液，輕柔混勻，室溫靜置5-10分鐘。離心收集上清液，并立即加入中和液（每1mL洗脫液加50-100μL中和液）調節pH至7.0左右，以保持蛋白活性。如需更高濃度，可重復洗脫一次，合并洗脫液。

 

　　5.beads再生與保存

 

　　使用過的beads可用再生緩沖液（如0.1M檸檬酸，pH3.0）清洗兩次，再用平衡緩沖液洗凈至中性，最后加入20%乙醇作為保護液，于4℃保存。通常可重復使用3-5次，結合能力無明顯下降。

 

　　三、注意事項

 

　　-整個操作盡量在冰上或冷室中進行，以保護蛋白活性。

 

　　-洗脫后立即中和，避免蛋白長時間處于酸性環境。

 

　　-若目標蛋白洗脫效果不理想，可嘗試不同pH的洗脫液（如pH2.2-3.5）或競爭性洗脫（如添加標簽肽）。

 

　　-納米抗體beads對剪切力敏感，離心轉速不宜過高，移液時使用剪口槍頭。

 

　　四、方法優勢

 

　　相比傳統ProteinA/G親和層析，納米抗體beads無需額外引入抗體標簽，可直接識別天然構象的目標蛋白。整個流程無需專用設備，普通離心管即可完成，從樣品到純化產物通常在2小時內完成，回收率可達80%以上，純度滿足大多數下游應用（如WB、ELISA、質譜分析）。