(2) 血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和連續(xù)性受到限制；

平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS ）簡(jiǎn)稱鹽溶液，集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)特點(diǎn)于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度、同時(shí)供給細(xì)胞生存所必需的能量和無(wú)機(jī)離子成分的作用。各種BSS的緩沖系統(tǒng)有所不同，其中以Hank’s液和Earle’s液為例，它們主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中比在Hank’s (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hank’s液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Earle’s液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hank’s液就可以了。

一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細(xì)胞膜的重要組成成分，同時(shí)參與許多重要的細(xì)胞功能活動(dòng)。但它們有使細(xì)胞凝集的作用，在配制分散細(xì)胞的消化液和特殊用途的細(xì)胞洗滌時(shí)，宜采用Ca2+、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks液，或者PBS液。

2.3基礎(chǔ)培養(yǎng)基

2.3.1 概述

基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加一定量的血清使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖

2.3.2 組成及作用

氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同的細(xì)胞對(duì)氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細(xì)胞可以自己合成，或通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)。絕大部分細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高的要求，因?yàn)楣劝滨０肥亲鳛槟茉?/p>

及碳源物質(zhì)同時(shí)被細(xì)胞利用，是是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡，所以各種培養(yǎng)液中都含有較多的谷氨酰胺。細(xì)胞所能利用的氨基酸是L型同分異構(gòu)體，D型氨基酸不能被利用。

維生素：維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞代謝有重大作用。它們?cè)诩?xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動(dòng)將無(wú)法進(jìn)行。維生素分為水溶和脂溶兩大類的培養(yǎng)液中直接采用ATP和fu酶A。

葡萄糖：大部分培養(yǎng)基都以葡萄糖作為能量來(lái)源之一。

無(wú)機(jī)鹽：維持培養(yǎng)基滲透壓平衡，參與細(xì)胞的代謝活動(dòng)。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是細(xì)胞外液中最主要的陽(yáng)離子，對(duì)維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)K+對(duì)于激活某些酶是必需的，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細(xì)胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。在懸浮培養(yǎng)時(shí)，為了減少細(xì)胞的聚集和附著，要減少Ca2+的濃度。

Mg2+是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的重要成分，對(duì)于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對(duì)細(xì)胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控有重要作用。

其他成分：肽、核苷、嘌呤等。可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。

2.4 低血清細(xì)胞培養(yǎng)基

2.4.1 概述

營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基是維持細(xì)胞活性及高密度生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，營(yíng)養(yǎng)缺乏容易引起細(xì)胞凋亡，新生牛血清中所含大部分營(yíng)養(yǎng)成分可以通過(guò)化學(xué)成分明確的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸維生素等成分組合取代。低血清培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分大優(yōu)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，僅需添加1％～5％新生牛血清，而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、形態(tài)、活性和功能沒有影響甚至有所改善。

在國(guó)外低血清培養(yǎng)基早已有之，如Gibco等。但是他們的低血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中選擇性的加入重組胰島素（recombinant insulin）、人源轉(zhuǎn)鐵蛋白（human (holo) tran- sferrin）以及牛血清白蛋白等，有些還包含一些生長(zhǎng)因子，這些重組蛋白和動(dòng)物來(lái)源成分對(duì)生物制品的安全性有很大影響。成本低。

三、細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.2細(xì)胞培養(yǎng)基的檢測(cè)方法

3.2.1 澄清度

水是細(xì)胞培養(yǎng)基的溶劑。細(xì)胞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分只有溶解于水才能被細(xì)胞吸收攝取，細(xì)胞才能生長(zhǎng)增殖，因此細(xì)胞培養(yǎng)基是否溶解以及培養(yǎng)液是否透明澄清直接影響培養(yǎng)基使用。該項(xiàng)目是通過(guò)對(duì)水溶解后的細(xì)胞培養(yǎng)基的澄清度檢查，判斷細(xì)胞培養(yǎng)基的澄清度。 按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅸ B進(jìn)行。

3.2.2 pH 值

哺乳類動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)需要合適的酸堿度，pH過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。pH值的測(cè)定也可以檢查細(xì)胞培養(yǎng)基的批間差。清大天一標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定取規(guī)定量供試品，用注射用水（水溫20℃-30℃）溶解至1L，加入規(guī)定量碳酸氫鈉到上述溶液中，用與細(xì)胞培養(yǎng)基溶液pH值相近的兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)后的酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進(jìn)行；加入規(guī)定量的碳酸氫鈉到上述溶液中，按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進(jìn)行

3.2.3 干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

細(xì)胞培養(yǎng)基具有吸濕性，在空氣中放置水分會(huì)很快升高，干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示產(chǎn)品中含濕量。細(xì)胞培養(yǎng)基是有菌制劑，其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分有利于微生物生長(zhǎng)，控制細(xì)胞培養(yǎng)基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持細(xì)胞培養(yǎng)基的養(yǎng)分。按中華人民共和國(guó)藥典2005 年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測(cè)定法進(jìn)行。

3.2.4 滲透壓

溶劑通過(guò)半透膜由低濃度向高濃度溶液擴(kuò)散的現(xiàn)象稱為滲透，阻止?jié)B透所需施加的壓力，稱為滲透壓。細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，動(dòng)物細(xì)胞借助K＋、Na＋維持滲透平衡。大多數(shù)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定的耐受性。但是培養(yǎng)液滲透壓過(guò)高容易使細(xì)胞脫水wei縮，培養(yǎng)液滲透壓過(guò)低容易使細(xì)胞膨脹破裂，因此要控制培養(yǎng)基的滲透壓范圍。按中華人民共和國(guó)藥典2005 年版二部附錄Ⅸ G 滲透壓摩爾濃度測(cè)定法進(jìn)行。

3.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素

細(xì)菌內(nèi)毒素是許多病原性細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素。它的特殊性在于不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來(lái)的一種具有生物活性的物質(zhì)。培養(yǎng)基細(xì)菌內(nèi)毒素過(guò)高，對(duì)生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細(xì)菌內(nèi)毒素。 因此本項(xiàng)目的檢驗(yàn)符合生物制品質(zhì)量控制要求。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)定為＜10 EU/ml。稱取本品規(guī)定量（見表4-12）的1/100，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水10 mL溶解，吸取該溶液0.1 mL加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水3.9 mL，混勻即得試樣。按中華人民共和國(guó)藥典2005 年版二部附錄Ⅺ E 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行。

3.2.6 微生物限度

細(xì)胞培養(yǎng)基不是無(wú)菌產(chǎn)品，其中的微生物在一定條件下會(huì)吸收細(xì)胞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滋生繁殖，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基變質(zhì)失效。控制細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)菌和霉菌，是延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基有效期的方法之一。清大天一在參考《中華人民共和國(guó)藥典》2005版二部附錄第100頁(yè)的口服給藥制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)于該標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的細(xì)菌數(shù)每1g不得超過(guò)200個(gè)，霉菌數(shù)每1g不得超過(guò)50個(gè)。

稱取樣品1 g，加入無(wú)菌純化水10 mL溶解，混勻即得試樣。按中華人民共和國(guó)藥典2005年版二部附錄Ⅺ J 微生物限度檢查法進(jìn)行，檢查項(xiàng)目為細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。

3.2.7 細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)

這是一個(gè)性能特性表述的要求。細(xì)胞培養(yǎng)基的功能就是培養(yǎng)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞，因此經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)效果的檢驗(yàn)是產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的直觀表述，這也是很多生物制藥用戶要求的一項(xiàng)指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)和計(jì)數(shù)的法定方法，可參考《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》中細(xì)胞計(jì)數(shù)法中論述的內(nèi)容給出。按產(chǎn)品說(shuō)明書配制培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，前四天用含10％小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)，檢查細(xì)胞培養(yǎng)基是否有促生長(zhǎng)的能力。后三天用不含小牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)，檢查細(xì)胞培養(yǎng)基中是否有不利細(xì)胞生長(zhǎng)的毒素。本試驗(yàn)用細(xì)胞為VERO細(xì)胞。

四、細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法

細(xì)胞培養(yǎng)基的種類繁多，細(xì)胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及很大程度地保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)每個(gè)培養(yǎng)者都很重要。培養(yǎng)基的使用依不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細(xì)胞種類的不同而存在差異。

4.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的構(gòu)成

細(xì)胞培養(yǎng)液指細(xì)胞生長(zhǎng)的液體環(huán)境，一般指培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。

4.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)基&血清模式

血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長(zhǎng)和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)是需要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)單獨(dú)的培養(yǎng)基并不能提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的全部營(yíng)養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3％左右，細(xì)胞的形態(tài)和功能不受影響。

4.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基&乳歐液模式

化學(xué)合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領(lǐng)域水解乳蛋白仍在使用，以補(bǔ)充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學(xué)合成培養(yǎng)基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。

4.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)基&各類添加劑（生長(zhǎng)因子等）模式

成分復(fù)雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的血清濃度減少時(shí)，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長(zhǎng)。激素和生長(zhǎng)因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無(wú)血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來(lái)代替血清中的激素能增加多種不同類型細(xì)胞的貼瓶率；生長(zhǎng)因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。

4.2細(xì)胞培養(yǎng)基配制

4.2.1 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制

1）配制過(guò)濾除菌的細(xì)胞培養(yǎng)基

(1) 閱讀培養(yǎng)基使用說(shuō)明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。

(2) 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。

(3) 加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。

(4) 輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。

(5) 用1 mol / L *溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。

(6) 用0.22 μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。

(7) 溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書。

2）配制可高壓滅菌細(xì)胞培養(yǎng)基

(1) 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解

(2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。

(3) 待溶液冷卻至室溫，加入無(wú)菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無(wú)菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。

(4) 如果必要，用1 mol / L *溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。

(5) 溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說(shuō)明書

4.2.2 注意事項(xiàng)

1） 細(xì)胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經(jīng)石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。

2） 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因?yàn)榘b一旦打開，組分可能會(huì)變質(zhì)或因受潮而結(jié)團(tuán)。

3） 溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積90％－95％的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補(bǔ)足。

4） 如需添加的組分較多時(shí)，某一組分溶解后，再添加另一組分。

5） 待培養(yǎng)基溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。

6） 所有成分溶解后，培養(yǎng)基應(yīng)立即過(guò)濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。

7） 在過(guò)濾除菌時(shí)，一般情況下應(yīng)調(diào)pH比所需值低0.1～0.2個(gè)單位，因過(guò)濾除菌后，pH值會(huì)升高約0.2。

8） 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應(yīng)降低一些。

4.3.1 高壓滅菌

某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺

為保證高壓滅菌的效果，滅菌設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵，可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下可達(dá)到滅菌效果及營(yíng)養(yǎng)成分的最小損失，因此不需將滅菌時(shí)間延長(zhǎng)。

4.3.2 過(guò)濾滅菌

大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)損失。

4.4 細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存

細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點(diǎn)：

1） 過(guò)濾后的培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2－3周內(nèi)使用完。培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解。

2） 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個(gè)月，也可冷凍保存，用時(shí)解凍

3） 高壓除菌后的培養(yǎng)基應(yīng)置4℃保存，不能因?yàn)槠淇赡褪芨邷囟雎詢?chǔ)存溫度。