mRNA展示(mRNA display)技術(shù)是一種基于基因型-表型偶聯(lián)原理的超高通量蛋白篩選技術(shù)，能夠在體外實現(xiàn)對萬億級規(guī)模蛋白或多肽分子庫的功能篩選。然而，傳統(tǒng)依賴細胞表達體系的蛋白篩選方法受到細胞轉(zhuǎn)化效率、蛋白毒性、表達容量以及復雜蛋白折疊限制，難以滿足現(xiàn)代蛋白工程和藥物發(fā)現(xiàn)對于超大規(guī)模分子多樣性的需求。

無細胞蛋白表達技術(shù)(cell-free protein synthesis, CFPS)通過在體外重構(gòu)翻譯過程，為mRNA展示提供了更加開放、高效和可調(diào)控的平臺環(huán)境，使研究人員能夠直接連接序列設(shè)計、蛋白表達和功能篩選過程。近年來，隨著無細胞表達體系、核糖體展示以及mRNA展示技術(shù)的發(fā)展，研究人員進一步將CFPS與蛋白定向進化結(jié)合，實現(xiàn)了超大規(guī)模蛋白庫構(gòu)建和功能篩選。最新研究表明，cell-free display技術(shù)正在成為蛋白工程和人工蛋白設(shè)計的重要工具。

1. mRNA展示技術(shù)的發(fā)展與基本原理

mRNA展示技術(shù)最早由Roberts和Szostak于1997年提出，其核心思想是利用嘌呤霉素(puromycin)作為連接分子，在翻譯過程中實現(xiàn)新生肽鏈與編碼mRNA之間的共價連接，從而形成穩(wěn)定的mRNA-protein融合分子[1,2]。

由于蛋白質(zhì)功能信息與遺傳信息被物理連接，研究人員可以首先利用功能篩選方法富集具有目標性質(zhì)的蛋白分子，例如高親和力結(jié)合蛋白，然后通過PCR擴增對應(yīng)mRNA序列，實現(xiàn)連續(xù)多輪體外定向進化。

隨后，大規(guī)模體外篩選技術(shù)不斷發(fā)展，研究人員利用mRNA展示體系實現(xiàn)了針對蛋白結(jié)合能力的高通量篩選，使其成為繼噬菌體展示之后的重要蛋白工程平臺[5]。

圖1：mRNA展示技術(shù)原理

(來源:https://doi.org/10.3389/fchem.2020.00447)

2. 無細胞蛋白表達體系為何成為mRNA展示的重要支撐技術(shù)?

傳統(tǒng)蛋白表達主要依賴細胞系統(tǒng)，例如大腸桿菌、酵母以及哺乳動物細胞。然而，對于mRNA展示而言，細胞體系存在天然限制。

首先，細胞轉(zhuǎn)化效率限制了文庫規(guī)模。即使采用高效電轉(zhuǎn)方法，單次實驗?zāi)軌蚋采w的突變庫規(guī)模通常在10?–10?范圍，而mRNA展示理論上可以達到1013級別。這意味著大量潛在功能蛋白無法通過傳統(tǒng)細胞篩選方式被探索。

其次，細胞環(huán)境對于蛋白表達存在嚴格限制。例如部分膜蛋白、毒性蛋白以及復雜折疊蛋白在宿主細胞中表達困難，而無細胞體系可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)環(huán)境，包括氧化還原狀態(tài)、分子伴侶以及膜模擬體系，實現(xiàn)對困難蛋白的表達支持。

與傳統(tǒng)細胞表達相比，無細胞基因表達體系避免了細胞存活和代謝限制，可以直接調(diào)控反應(yīng)體系中的DNA、RNA、核糖體以及能量模塊，因此能夠支持快速原型驗證、高通量篩選以及復雜蛋白表達等應(yīng)用場景[4]

圖2：無細胞表達體系的應(yīng)用

(來源：https://doi.org/10.1038/s43586-021-00046-x)

3. CFPS體系如何提升mRNA展示性能?

mRNA展示的核心要求是：高效率蛋白翻譯;穩(wěn)定的mRNA-protein偶聯(lián);蛋白正確折疊;保持篩選過程中蛋白功能。

傳統(tǒng)細胞裂解型CFPS體系雖然具有較高蛋白產(chǎn)量，但由于包含大量細胞組分，可能存在核酸酶、蛋白酶以及代謝背景干擾。

近年來，PURE系統(tǒng)(Protein synthesis Using Recombinant Elements)通過純化核糖體、翻譯因子和能量系統(tǒng)，實現(xiàn)了更加精準可控的體外蛋白合成環(huán)境。

Shimizu等人在2001年建立PURE系統(tǒng)，通過重構(gòu)37種純化因子，實現(xiàn)了定義條件下的蛋白表達，為后續(xù)mRNA展示和蛋白工程研究提供了重要基礎(chǔ)[3]。

4. 無細胞表達技術(shù)推動困難蛋白和膜蛋白發(fā)現(xiàn)

在藥物研發(fā)領(lǐng)域，大量關(guān)鍵靶點屬于傳統(tǒng)表達體系難以處理的蛋白，例如GPCR、離子通道以及跨膜蛋白。

膜蛋白約占人類蛋白組20%以上，同時也是超過50%的藥物作用靶點。然而，由于疏水結(jié)構(gòu)和復雜折疊需求，其表達一直是蛋白工程領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)。

無細胞表達體系可以通過加入：去垢劑(detergent)、脂質(zhì)體、納米盤(nanodisc)，模擬天然膜環(huán)境，提高膜蛋白表達和功能保持。

圖3：無細胞膜蛋白表達策略

(來源：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072272)

5. 珀羅汀生物(PLD Technology)：面向蛋白發(fā)現(xiàn)的新一代無細胞表達平臺

隨著mRNA展示、蛋白定向進化以及AI蛋白設(shè)計的發(fā)展，科研人員對于無細胞表達平臺的需求已經(jīng)從“能否表達蛋白"轉(zhuǎn)向：是否能夠快速獲得具有正確結(jié)構(gòu)和功能的蛋白分子。

蘇州珀羅汀生物(PLD Technology)專注于無細胞蛋白表達技術(shù)開發(fā)，為蛋白工程、藥物發(fā)現(xiàn)以及復雜蛋白研究提供技術(shù)支持。

基于自主優(yōu)化的CFPS體系，珀羅汀平臺針對傳統(tǒng)表達體系中的關(guān)鍵痛點進行優(yōu)化，包括：

√ 高效率蛋白表達;

√ 二硫鍵蛋白折疊環(huán)境優(yōu)化;

√ 膜蛋白表達體系開發(fā);

√ 蛋白功能驗證與篩選支持。

特別是在mRNA展示等高通量蛋白篩選場景中，高質(zhì)量無細胞表達體系能夠幫助研究人員縮短從序列庫構(gòu)建到功能評價的研發(fā)周期，提高蛋白發(fā)現(xiàn)效率。

參考文獻

[1] Roberts RW, Szostak JW. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. PNAS. 1997;94:12297-12302.

[2] Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett. 1997 Sep 8;414(2):405-8.

[3] Shimizu Y, et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 2001;19:751-755.

[4] Silverman AD, Karim AS, Jewett MC. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 2020;21:151-170.

[5] Wilson DS, Szostak JW; New Collective Author. In vitro selection of functional nucleic acids. Annu Rev Biochem. 1999;68:611-47.