手性含氮雜環是藥物分子、農用化學品、精細化工中間體的核心骨架，其中2,6 - 二取代手性哌啶廣泛存在生物堿、抗過敏、抗癌藥物結構中。傳統化學合成路線步驟冗長、保護基繁瑣、立體選擇性差；游離酶催化又存在催化劑難回收、批次反應效率低、副產物難控制等痛點。

近期《Advanced Synthesis & Catalysis》發表意大利米蘭大學、意大利國家化學技術研究所聯合團隊重磅成果：將固定化 ATA-117 轉氨酶與連續流反應器結合，開發一套化學 - 酶耦合流動合成體系，實現天然生物堿 (-)- 匹尼酮 ((–)-pinidinone) 及系列多取代順式 (2R,6R)- 哌啶綠色、可放大制備，兼顧高轉化率、優異非對映選擇性與催化劑重復利用性，為手性氮雜環工業化生物催化提供全新思路。

一、研究背景：手性哌啶合成的行業痛點

1.藥物剛需，但傳統合成短板突出嗎啡、阿托品、各類抗組胺、抗腫瘤藥物均含哌啶環；手性直接決定藥效、毒副作用。現有合成路線：吡啶不對稱加氫、曼尼希串聯、有機催化環化，普遍依賴貴金屬催化劑、嚴苛高溫高壓，分離成本高。 生物催化中轉氨酶（ω-TA）是手性胺合成明星酶，依靠 PLP 輔酶實現高對映選擇性胺化，但游離酶存在三大硬傷：無法回收、批次反應耗時久、難以對接連續化生產線

2.天然產物 (-)- 匹尼酮合成現存難題 (-)- 匹尼酮是松屬植物來源生物堿，兼具抗菌、抗炎、神經調節活性。已報道全合成路線多需多步保護 - 脫保護，總收率低、非對映異構體難以拆分；前人雖開發游離 ATA-117 一鍋轉氨 / 氮雜邁克爾環化路線，但僅局限間歇小試，無法規模化。

3.本研究核心目標

1.       構建可回收固定化 ATA-117 生物催化劑；

2.       搭建連續流反應系統，解決游離酶副產物累積、反應慢問題；

3.       開發雙路進料工藝抑制亞胺、邁克爾加成副產物；

4.       拓展底物適用范圍，兼容芳基、羧酸酯取代哌啶衍生物；

5.       配套在線后處理，實現全流程自動化、降低人工操作。

二、核心實驗突破：從間歇酶優化到連續流成套工藝

（一）游離重組 ATA-117 間歇體系系統篩選

團隊在大腸桿菌中異源表達帶 His 標簽 ATA-117，對比商業凍干粗酶、純化重組酶、細胞裂解粗酶活性差異：

1.       純化酶間歇條件：底物 50 mM、異丙胺 (IPA) 750 mM、PLP 1 mM、酶濃度 2 mg/mL、10% DMSO 助溶，30 ℃僅 5 h 實現底物轉化；

2.       細胞裂解粗酶活性大幅衰減，48 h 才轉化完成，證明純化酶是固定化合適原料；

3.       間歇反應產物非對映比僅 8:2（順式：反式），后續無需差向異構即可通過流動工藝大幅提升選擇性。

（二）兩種載體酶固定化對比，Eupergit C 綜合性能好

研究選用兩種主流固定化載體，對比負載率、活性回收率、穩定性：

1.       Eupergit C（環氧共價固定） 負載量 40 mg 酶 /g 載體，固定化率＞99%；活性回收率 18%；優勢：共價結合無酶泄漏，耐緩沖、可多次循環。

2.       EziG Amber（金屬親和固定，結合 His 標簽） 固定化率 88%，活性回收率 19%；短板：同等底物濃度下反應速率遠低于 Eupergit C 固定酶，10 mM 底物需 96 h 轉化完成。

固定化酶穩定性測試

·       操作循環穩定性：10 mM 底物間歇循環反應，前 4 輪轉化率接近 100%，第 9–10 輪活性下降約 50%，副產物增多；

·       儲存穩定性：4 ℃冷藏 1 個月，每周檢測催化活性，全程保持 99% 底物轉化，儲存穩定性優異。

（三）連續流反應器迭代：單路進料缺陷→雙路分流進料解副反應

1. 初代單一進料（底物 + IPA 預混）致命缺陷

底物烯二酮與高濃度異丙胺提前在管路發生非酶促反應，生成大量亞胺中間體、烯酮 - IPA 邁克爾加合物副產物；合適條件底物轉化率僅 59%，目標順式哌啶產物占比不足 25%，大量原料被副反應消耗，不具備應用價值。

2. 創新雙泵分流進料體系（核心創新點）

兩路溶液在進入酶填充床前 T 型接頭瞬時混合：一路含底物 + PLP 緩沖液，另一路單獨輸送異丙胺溶液，極大縮短底物與高濃度氨基供體預接觸時間，從源頭抑制非酶促副反應。

連續流條件優化關鍵數據（合適工藝）

·       底物濃度 20 mM，IPA 200 mM（10 當量）；

·       溫度 30 ℃，停留時間 60 min；

·       雙路等流速泵送，總流速 16.8 μL/min；

·       底物轉化完成，產物順式 (2R,6R): 反式 = 98:2，非對映純度 96% de，遠超間歇反應；

·       升溫至 40 ℃可提升轉化，但需背壓閥抑制異丙胺揮發，綜合能耗選擇 30 ℃更可持續。

（四）自動化在線后處理，打通制備級放大鏈路

在流動反應柱后端集成連續萃取模塊：在線通入 NaOH 調堿、乙酸乙酯兩相萃取，搭配 Zaiput 連續分相器，有機相直接收集濃縮，省去批次繁瑣調 pH、分液操作，大幅降低人工干預，適配長期連續運行。

三、工藝優勢：流動生物催化 VS 傳統間歇酶反應

表格

制備級放大實驗：裝填 1.3 g 固定化酶，1 mL 填充床反應器，連續運行 32 h，粗 (-)- 匹尼酮收率 94%，柱層析純化后單一立體異構體，對映過量 ee=97%；催化劑出料后復測活性，仍可實現底物轉化完成。

四、底物拓展：通用型平臺適配多類 2,6 - 二取代哌啶

團隊基于相同流動催化體系，合成 5 類不同骨架手性順式哌啶：

1.       (-)- 匹尼酮（烷基酮側鏈，天然生物堿）；

2.       苯基取代哌啶酮（芳基藥用中間體）；

3.       甲酯、芐酯、叔丁酯取代 γ- 氨基哌啶（氨基酸類藥物砌塊）；

全部底物均實現高順式選擇性，粗產物反式異構體含量＜2%，簡單閃柱層析即可分離純品，證明該固定化酶 - 連續流平臺具備普適性，不受側鏈酯基、芳基、烷基結構限制。

五、研究總結與行業價值

1. 核心創新亮點

1.       將固定化 ω- 轉氨酶 ATA-117 與雙路進料連續流耦合，實現天然 (-)- 匹尼酮化學 - 酶一體化合成；

2.       提出分流進料策略，從根源解決胺供體與烯酮底物提前發生副反應的行業難題；

3.       共價固定化酶兼具優異儲存與循環穩定性，比間歇游離酶生產效率提升 4.6 倍；

4.       集成在線連續萃取，構建全自動化、可放大手性氮雜環合成流水線；

5.       底物適用范圍廣，覆蓋生物堿、芳基酮、氨基酯類高價值藥物中間體。

2. 工業化與綠色合成意義

·       綠色低碳：酶催化溫和常溫水環境，避免重金屬、強氧化還原試劑，三廢大幅減少；

·       成本可控：固定化酶反復使用，降低酶制劑單次生產成本；連續流占地小、批次重復性高；

·       藥物合成賦能：快速構建高立體純度 2,6 - 二取代哌啶骨架，簡化生物堿、手性 API 中間體生產路線，縮短研發與中試周期。

3. 未來展望

該流動生物催化框架可拓展至其他轉氨酶、還原酶復合串聯催化；通過載體改性進一步提升酶活性回收率；放大填充床體積、優化流速，推進公斤級藥物中間體連續化生產，為生物制造替代傳統高污染化學合成提供成熟范本。