在Western blot中，內參與目的蛋白的分子量差異是一個常被忽視但至關重要的細節。選擇不當可能導致信號干擾或轉膜效率不一致。

核心原則：分子量相差5 kDa以上

目的蛋白與內參的分子量應至少相差5 kDa。主要原因：

l 避免條帶重疊：若二者分子量過近，在膜上位置接近，可能相互干擾或難以剪膜分染。

l 確保轉膜效率匹配：不同分子量的蛋白轉移到膜上的效率不同，差距過小可能無法反映真實比例。

不同分子量目的蛋白的內參推薦

轉膜策略提示

如果目的蛋白分子量很大（>150 kDa），建議使用濕轉并延長轉膜時間，同時選擇較大分子量的內參（如vinculin），避免小分子內參轉穿膜。

如果同時檢測小分子目的蛋白（<25 kDa）和常規內參，可考慮先切膜，分別孵育抗體，或使用低分子量特異性內參（如Histone H3用于核蛋白）。

選擇內參時，既要關注表達穩定性，也要從分子量角度優化實驗方案，確保檢測結果真實可靠。

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