懸浮細胞因其在培養液中均勻分布、無需消化即可直接收集的特點，在多種下游實驗中具有先天優勢。本章節將聚焦懸浮細胞常用的兩大下游實驗——流式細胞術檢測與RNA提取，系統梳理從樣品制備到實驗完成的核心步驟與關鍵注意事項。

流式細胞術檢測——樣品制備與染色流程

流式細胞術是分析懸浮細胞表面標志物、細胞周期、凋亡狀態等特性的重要工具。懸浮細胞因無需消化，樣品制備更為簡便快捷。

1. 樣品制備

首先收獲細胞，制備單細胞懸浮液。根據細胞數量和體積，將懸液轉移到96孔板、試管或Falcon流式管中。需注意的是，如果細胞未經任何處理直接上機檢測，所有步驟應在冰上操作，并使用4℃預冷的試劑，以防止細胞表面蛋白的內化。

2. 細胞計數與活力檢查

確定細胞總數并檢查細胞活力。一般來說，細胞存活率應達到90%~95%方可進行流式分析。如果用于凋亡檢測，則需在染色后盡快完成檢測，通常宜在1小時內完成。

3. 細胞洗滌與重懸

在4℃下以約200g離心5分鐘，棄上清后，在冰冷的懸浮緩沖液中重懸細胞沉淀。推薦的懸浮細胞濃度為0.5-1×10?個/mL。離心力和時間可能需要根據細胞類型進行優化——應充分離心以便去除上清液，但離心力不宜過大，以免細胞難以重懸。

注意：較高細胞濃度可能會堵塞流式細胞儀系統并影響分辨率。

4. 活細胞/死細胞染色（活力染料）

死細胞容易與抗體發生非特異性結合，必須在分析時排除。活力染料（如7-AAD、DAPI等）無法穿透活細胞的完整細胞膜，只能對死細胞進行染色。

染色步驟：根據制造商說明，在4℃避光條件下用活力染料孵育細胞。選擇發射光譜不與免疫染色所用熒光團重疊的染料。染色后，用洗滌緩沖液洗滌細胞兩次（200g離心5分鐘，4℃），每次洗滌后重新懸浮沉淀。

注意：DAPI等活力染料不能用于固定細胞后的活/死染色，因為固定過程會損害所有細胞的細胞膜，導致假陽性。此時應使用胺反應性可固定細胞活力染料

5. 抗體標記

將細胞重懸后，加入相應的熒光素偶聯抗體，孵育后洗去未結合的抗體，用流式PBS重懸細胞于流式管中，即可上樣分析。

6. 流式樣品制備關鍵要點

防止細胞損傷：避免出現氣泡、劇烈渦旋、更換緩沖液時吸出全部溶液以及過度離心

細胞染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時內完成-

將熒光團保存在黑暗中以避免光漂白

懸浮細胞RNA提取——Trizol法完整操作流程

懸浮細胞在RNA提取中具有獨特優勢——無需胰酶消化，可直接離心收集，避免了消化過程對細胞狀態的影響。

1. 細胞收集與裂解

將細胞懸液轉移至離心管中，室溫下以1000 rpm離心6分鐘，棄去上清。參考不同來源方法，也可采用12000 rpm 4℃離心2分鐘收集細胞，之后用預冷的1×PBS清洗兩次-。

對于懸浮細胞，可直接用吸管或移液槍吹打培養瓶壁，使細胞充分懸起，然后離心去上清，不需要用PBS提前洗滌-。隨后加入Trizol裂解液，每5-10×10?個細胞加入1ml Trizol，反復用移液槍吹打或劇烈震蕩以裂解細胞。

2. 相分離

將混合好的樣品全部移至1.5ml EP管中，室溫靜置5分鐘。加入0.2ml氯仿（每1ml Trizol），蓋好管蓋，劇烈振蕩（上下顛倒）15秒，室溫靜置2-3分鐘。

2-8℃下以10500 rpm離心15分鐘。此時樣品分為三層：上層無色水相含RNA，中間層為蛋白質，下層有機相含DNA。小心取上層水相（約0.5-0.55ml）移至新的離心管中，注意不要觸及中間界面。

3. RNA沉淀與洗滌

在上清中加入等量的異丙醇，顛倒混勻5次，室溫靜置10分鐘。2-8℃下以10500 rpm離心10分鐘，棄上清，可見RNA沉淀于管底。

加入1ml75%乙醇洗滌沉淀，輕輕彈起管底，2-8℃下以8500 rpm離心5分鐘，棄上清。

4. RNA溶解與保存

將EP管敞開放在濾紙上，管口朝向酒精燈方向，室溫干燥（注意不要完-全干燥，否則RNA不易溶解）。用DEPC水溶解RNA（約30μl），分裝后取2μl電泳檢測完整性、2μl進行濃度測定，其余分裝保存于-20℃備用。

5. RNA提取關鍵注意事項

l 防止RNase污染：全程戴好口罩和手套，使用無RNase的槍頭、離心管等耗材

l 試劑安全：Trizol含有酚等有害物質，注意個人防護，操作應在通風良好的環境中進行

l 細胞裂解充分：確保移液管反復吹打直至細胞完-全溶解

l 避免DNA污染：相分離時切勿吸取中間蛋白層和有機相

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