實驗目的】
    1.掌握用CaCl2法制備感受態(tài)細胞的原理和方法。
    2.學習和掌握質粒DNA的轉化和重組質粒的篩選方法。
    【實驗原理】
    質粒在不同的細菌之間轉移是微生物世界中一種普遍的現(xiàn)象，一個細菌品系通過吸收另一個細菌品系的質粒DNA而發(fā)生了遺傳性狀的改變，這種現(xiàn)象叫做轉化，獲得了外源DNA的細胞稱為轉化子。
    在基因克隆技術中，所謂轉化是指質?；蛑亟M質粒被導入受體細胞，表達相應的選擇標記基因，并在一定的培養(yǎng)條件下，在選擇性培養(yǎng)基上長出轉化子的過程。
    質粒必須通過轉化進入細菌細胞內，才能進行擴增和表達，從而獲得大量的克隆基因,使我們能夠進行進一步的DNA操作，如亞克隆等；或者獲得其表達產物。轉化效率的高低與受體菌的生理狀態(tài)有關。細菌吸收外源DNA的能力最高時的狀態(tài)被稱為感受態(tài)細胞（competentcell）。
    有些種類的細菌在其生長的任一階段都處于感受態(tài)，而另一些細菌只有處于某個生長時期時（一般為對數(shù)生長早、中期），才會處于感受態(tài),如本實驗所用的大腸桿菌。用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長早中期的細菌可以大大提高細菌吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的能力。
    對這種現(xiàn)象的一種解釋是CaCl2能使細菌細胞壁的通透性增強，從而提高轉化率。這種轉化方法稱為“化學法"。目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流，在細胞上形成孔洞，使外源DNA進入胞內，從而實現(xiàn)細胞的轉化。
    電激轉化的效率往往比化學法高出1到2個數(shù)量級，達到1X108轉化子/μgDNA，甚至1X109轉化子/μgDNA，所以常用于文庫構建時的轉化或遺傳篩選。
    微生物轉化是基因工程的常用技術，大腸桿菌是基因工程中常用的受體菌，本實驗即是用前面實驗獲得的重組質粒轉化大腸桿菌細胞。
    【試劑與器材】
    <一>試劑
    1．LB液體培養(yǎng)基:參見附錄
    每組配200mL,其中100mL分裝于500mL三角瓶中，另各取3mL裝于2只大試管中，其余裝于裝于500mL三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。
    2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:
    配1LLB液體培養(yǎng)基，加入20g瓊脂粉和1支攪拌棒，同上高壓滅菌，趁熱取出置攪拌器上冷卻，待冷至55℃左右,加氨芐青霉素(Ampicillin)至終濃度100μg/ml(Amp儲存液一般為100mg/mL),倒平板，每皿倒約15mL，室溫放置過夜至冷凝水揮發(fā)干凈。使用前半小時在培養(yǎng)基表面加20μL50mg/mLX-gal和100μL0.1mol/LIPTG，涂勻，待這兩種化合物滲入瓊脂后，即可用于轉化菌的涂布。
    每組制備LB平板2個，LB/Amp平板5個，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6個。
    3．IPTG儲存液(0.1mol/L)：1.2gIPTG加水至50ml，過濾除菌，4℃儲存。
    4．X-gal儲存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶劑中，過濾除菌，4℃儲存。
    5．1mol/LCaCl2儲存液，使用濃度為0.1mol/L，CaCl2應使用分析純，配100mL，高壓滅菌，全班用。
    6．甘油(滅菌)，全班50mL，同上高壓滅菌。
    7．酸洗無菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝，同上高壓滅菌，烘干備用。
    <二>器材
    1.37℃溫箱、水浴鍋、恒溫振蕩器等
    2.高速冷凍離心機
    3.微量移液器等
    <三>菌株
    大腸桿菌DH5α
    【操作方法】
    1、感受態(tài)細胞的制備（無菌操作）
    1）從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑單個DH5α大菌落接種到3mLLB培養(yǎng)液中（2），37℃劇烈振蕩（210-240r/min）培養(yǎng)過夜（3）。
    2）取1mL過夜培養(yǎng)物,接種到含100mLLB培養(yǎng)液的500mL錐瓶中，37℃劇烈振蕩，直至培養(yǎng)液中細菌濃度達到OD600為0.375-0.4（4）
    3）培養(yǎng)物轉入2只50mL離心管中，冰上放置10分鐘，4,000r/min,4℃離心15分鐘，棄上清（5）。
    4）將菌體懸浮于10～20mL預冷的0.1mol/LCaCl2溶液中,冰上放置20分鐘(6)。
    5）4,000rpm,4℃,離心10分鐘，棄上清，然后將細菌輕輕懸浮在2ml0.1mol/LCaCl2溶液中（7）。若不立即進行轉化實驗，則進行第6步操作，反之，則進入轉化操作。
    6）緩慢滴入甘油(滅菌)至終濃度為15％,輕柔混勻，將細菌分裝成0.5ml/每管，立即液氮冷凍，轉入-70℃冰箱儲存，可在2個月內使用（8）。
    2、感受態(tài)細胞的轉化
    1）設計好實驗項目，如正、負對照（參考如下表格，按表格內容操作）；
    2）從-80℃冰箱中取出分裝成0.5mL/每管的感受態(tài)細胞,置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好解凍（10），立即分裝到預冷的1.5mL離心管中，每管體積參見上表，插入冰上待用；
    3）對轉化管，加入連接產物DNA溶液，輕輕混勻；為保險起見，也可先加入一半的連接產物DNA溶液，輕輕混勻，剩下的一半置-20℃冰箱保存；
    4）冰上放置30分鐘（11）；
    5）放入42℃水浴中，熱激40秒（12）；
    6）迅速插入冰上，放置5分鐘；
    7）對第1、2項，加入500μLLB培養(yǎng)基，其余加入250μLLB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)1小時（13）；
    8）對第1項，各取200μL直接用玻璃珠涂布于2個LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上；對第2項，分別取3、30和100μL細菌培養(yǎng)液，各加無菌水至150μL（不超過200μL）涂LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（此步驟的目的是計算轉化率）；對其余各項，分別各取一半涂布于LB/Amp平板上，余下的轉化液置4℃冰箱保存（14）。倒置平板，37℃培養(yǎng)12-14小時。一般來說，含有活性半乳糖苷酶的細菌比無活性酶的細菌生長慢，故過夜培養(yǎng)后可見到毫米大小的陽性白色菌落而陰性的蘭色菌落只有針尖大?。?5）。
    9）挑取白色菌落進行鑒定（見下一個實驗）。
    【注意事項與提示】
    （1）倒平板時應避免培養(yǎng)基溫度過高，若溫度過高，則加入的氨芐青霉素會失效，且培養(yǎng)基凝固后表面及皿蓋會形成大量冷凝水，易于造成污染及影響單菌落的形成。若用手掌感受培養(yǎng)基覺得很燙但尚可忍受時，培養(yǎng)基溫度即為55℃左右。制備好的LB/Amp平板可于4℃冰箱儲存2個月，時間過長氨芐青霉素將會失效。加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好現(xiàn)用。
    （2）DH5α在平板上過夜生長后，可置冰箱中保存一個月左右；接種新鮮的菌落或菌液有利于細菌細胞的同步快速生長，從而使細菌群體在達到一定的OD值后（0.375）大部分細胞都處于感受態(tài)。
    （3）DH5α的生長需要氧氣，劇烈振蕩的目的是提高培養(yǎng)基的溶氧量以利于細菌的生長
    （4）達到細菌對數(shù)生長早、中期，需時約2.0~2.5小時，此步驟至為關鍵，若超過此階段，則轉化效率急劇下降。
    （5）低溫操作的目的是使細胞不再生長，保持其感受態(tài)。
    （6）此步驟的目的是洗滌細胞。
    （7）此時細胞較脆，懸浮時動作要輕，可用移液槍輕輕吸打。
    （8）-70℃冰箱儲存的感受態(tài)細胞在6-8周后，轉化率很快降低?？捎靡灰阎獦藴始皾舛鹊拈]環(huán)質粒如pUC18/19鑒定感受態(tài)細胞的轉化能力。
    （9）實驗中一定要設計正負對照，如用無DNA轉化物的感受態(tài)細菌鋪板，若有菌落生長，說明其中抗生素濃度不夠或感受態(tài)細胞已被污染。加樣時速度要快，但要有條不紊，切勿加錯！加完樣用槍尖稍攪勻。第1項中所加連接產物的量可根據連接反應的終體積而定，一般加一半或2/3，其余置－20℃保存。
    （10）從-80℃冰箱中取出冷凍的指管后，也可用雙手搓指管，利用掌心的溫度解凍。解凍時間勿過長。
    （11）至少30min，可延長至1h左右。
    （12）掌握時間，過長會致死細胞。在許多實驗方案中，熱激時間設為90至120秒，目前已有實驗證明如此長的熱激時間是沒有必要的，且會引起轉化效率的下降。熱激前加入相當于轉化液體積1/10的DMSO可提高轉化效率10倍左右，加入DMSO后請勿再劇烈振蕩。
    （13）此步驟使得細菌恢復正常并讓β-內酰氨酶基因表達。
    （14）此步驟可在實驗出現(xiàn)錯誤后進行補救。
    （15）培養(yǎng)時間勿過長，以免衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。很多因素都可以影響轉化的效率，特別需要注意的有兩點，一是制備感受態(tài)細胞時的OD值，二是所用試劑要分析純以上，并用雙蒸水或超純水（如MiliQ）配制。
    【實驗安排】
    實驗前兩天挑E.coli菌種在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。實驗前一天各組要將試劑準備好，包括培養(yǎng)基的消毒滅菌。下午臨下課時從平板上挑新鮮的單菌落接種到3mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。轉化完畢，次日一早觀察記錄結果，并清理余下的菌種試劑等。
    【實驗報告要求與思考題】
    1．制備感受態(tài)細胞和轉化時，應特別注意哪些環(huán)節(jié)。
    2．轉化效率的計算：轉化效率是指每微克質粒DNA轉化細胞產生的轉化子數(shù)目，請列表表示你的轉化結果并算出轉化率（列出計算公式）。你所做實驗的轉化效率（正對照）是多少？如果過低（如低于104cfu/μgDNA），請分析可能的原因。需要注意的是，連接產物的轉化效率是非常低的，為什么？
    3．若實驗出現(xiàn)不正常的結果，請分析原因。
    附錄：大腸桿菌的高效轉化方法
    一、試劑
    TB溶液：1.512gPIPES，1.1025gCaCl2，9.31875gKCl，溶于水，以5NKOH調pH6.7，再加入5.44225gMnCl2，定容至500ml，0.22?m濾膜過濾滅菌，4℃保存。
    SOB培養(yǎng)基：Tryptone20g(OXOID公司)；Yeastextract5g(OXOID公司)；NaCl0.5g，加800ml雙蒸水，加入250mmol/LKCl溶液10ml，用10mol/LNaOH調pH至7.0，定容至1,000ml，高壓滅菌，4℃保存；使用前加入5ml經高壓滅菌的2mol/LMgCl2溶液。
    SOC培養(yǎng)基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基，SOB培養(yǎng)基高壓滅菌后，降溫至60℃或以下時，加入20ml經過濾除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4℃保存。
    DMSO
    二、方法
    （一）感受態(tài)細胞的制備
    1.將E.coliDH5α，涂布于LB(A-)培養(yǎng)基上，37℃過夜。
    2.挑取2-3個直徑2-3mm的大菌落，接種到50mlSOB培養(yǎng)基中。在250ml三角瓶中18℃，200-250rpm振蕩培養(yǎng)，直到OD=0.6，約需要36-48hr。
    3.將三角瓶冰浴10分鐘。
    4.轉移菌液到50ml離心管。2,500g，10min，4℃。
    5.菌體用16ml冰預冷的TB溶液懸浮，冰浴10min。
    6.2,500g，10min，4℃。
    7.菌體用4ml冰預冷的TB溶液懸浮，加入280ulDMSO。
    8.菌液于冰浴10分鐘后分裝到凍存管。每管200ul。液氮冷卻，保存于液氮中。大月0分鐘后，轉移到-40℃冰箱保存。
    （二）轉化
    1.將LB抗性平板，SOC培養(yǎng)基，于37℃預熱。
    2.室溫溶解感受態(tài)細胞。
    3.取200uL菌液加入1.5mL離心管中，放于冰中。
    4.加入1-5uL質粒溶液，用槍頭混勻，冰浴30min。
    5.42℃熱激30秒，冰浴。
    6.加入800uLSOC培養(yǎng)基，37℃，250r/min，1hr。
    7.涂布LB抗性平板，37℃過夜。