永生化就是通過(guò)細(xì)胞自身的基因變化或外界的各種刺激因素，使正常的細(xì)胞突破了正常的細(xì)胞衰老，延長(zhǎng)了其復(fù)制能力，甚至使細(xì)胞無(wú)限增殖的過(guò)程。正常細(xì)胞在體外的增殖次數(shù)是有限的。永生化正是利用細(xì)胞自發(fā)的，或通過(guò)轉(zhuǎn)基因或其他刺激等使細(xì)胞能順利突破增殖次數(shù)的限制，減少科研工作者從組織中分離原代細(xì)胞的次數(shù)的一種手段。一般情況下，人類細(xì)胞的自發(fā)永生化的概率非常低，所以一般通過(guò)導(dǎo)入諸如SV40、hTERT、HPV的E6/E7等基因的方法使細(xì)胞永生化。雖然理論上，永生化是可以讓細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力，但在實(shí)際操作中，可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞的來(lái)源、類型、所選用的基因是否合適等情況，而使所獲得的“永生化"細(xì)胞未能獲得無(wú)限增殖的能力。其中一個(gè)例子就是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心所構(gòu)建的一株細(xì)胞PUMC-HUVEC-T1，該細(xì)胞希望通過(guò)導(dǎo)入SV40T基因進(jìn)行永生化，但細(xì)胞在體外也僅能傳至40代，之后細(xì)胞開始衰老，而并不能無(wú)限傳代。綜上，雖然永生化理論上是可以使細(xì)胞無(wú)限傳代，但實(shí)際中還是需要去測(cè)試才知道具體效果。

結(jié)論先說(shuō)：理論上具備無(wú)限增殖潛能，但實(shí)際實(shí)驗(yàn)室做不到真正yon久、無(wú)限制傳代，存在上限與淘汰風(fēng)險(xiǎn)，分兩層講清楚。

一、分子層面：確實(shí)突破了 Hayflick 極限，擁有 “永生潛力"

正常原代細(xì)胞分裂 50 次左右，因端粒縮短、p16 衰老通路激活停止生長(zhǎng)。

永生化細(xì)胞通過(guò)兩種方式突破衰老關(guān)卡：

hTERT 系統(tǒng)：持續(xù)修復(fù)端粒，每次分裂端粒不會(huì)變短；

SV40T / HPV E6E7：抑制 p53/Rb 衰老檢查點(diǎn)，即便端粒縮短也不進(jìn)入復(fù)制性衰老。

從細(xì)胞周期、端粒調(diào)控機(jī)制上，不存在天然分裂次數(shù)封頂，具備無(wú)限傳代的遺傳基礎(chǔ)。

典型例子：HeLa 細(xì)胞自 1951 年至今體外傳代 70 多年，仍能增殖。

二、現(xiàn)實(shí)培養(yǎng)中：不可能無(wú)限制一直傳下去，會(huì)出現(xiàn) 3 類 “終止增殖" 問(wèn)題

1. 基因組累積突變、染色體畸變（最主要原因）

細(xì)胞每一次分裂都有極低概率 DNA 復(fù)制錯(cuò)誤：

SV40、HPV 永生化細(xì)胞：抑癌通路被破壞，DNA 損傷修復(fù)能力下降，長(zhǎng)期傳代（幾十代后）大量出現(xiàn)非整倍體、染色體斷裂；

hTERT 細(xì)胞雖穩(wěn)定，但上百代后也會(huì)積累突變。

突變積累到一定程度會(huì)出現(xiàn)兩種結(jié)局：

① 細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、形態(tài)異常、批量衰老死亡；

② 發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，變成腫瘤樣細(xì)胞，不再是你需要的永生化細(xì)胞模型，只能棄用。

2. 培養(yǎng)環(huán)境帶來(lái)的選擇壓力與衰老

血清批次、pH 波動(dòng)、氧自由基、營(yíng)養(yǎng)匱乏、頻繁凍融復(fù)蘇，都會(huì)持續(xù)損傷細(xì)胞；

長(zhǎng)期高密度培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生 SASP 衰老相關(guān)分泌因子，誘導(dǎo)周圍細(xì)胞老化；

很多細(xì)胞傳至 80–150 代就明顯長(zhǎng)勢(shì)衰退。

3. 細(xì)胞亞群分化、優(yōu)勢(shì)株替代，丟失原有細(xì)胞特性

永生化細(xì)胞群不是wan全均一的：

傳代幾百代后，少數(shù)增殖更快的突變細(xì)胞會(huì)慢慢占據(jù)培養(yǎng)瓶，原本具有正常功能的細(xì)胞被淘汰。

比如永生化腎小管細(xì)胞傳代過(guò)久，腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝酶大幅下調(diào)，失去實(shí)驗(yàn)價(jià)值，即便還能長(zhǎng)，也不能再用。

三、不同永生化體系傳代穩(wěn)定性對(duì)比

hTERT / K4DT 細(xì)胞（優(yōu)）

抑癌通路完整、基因組穩(wěn)定，常規(guī)穩(wěn)定傳代 100–200 代；超過(guò) 200 代仍會(huì)緩慢積累突變，建議 100 代內(nèi)做實(shí)驗(yàn)。

SV40 大 T 抗原永生化細(xì)胞

p53/Rb 被抑制，染色體極易異常，多數(shù)傳 50–100 代就明顯退化。

腫瘤來(lái)源永生細(xì)胞（HeLa、HepG2）

本身基因組高度紊亂，雖然能長(zhǎng)期增殖，但細(xì)胞特性持續(xù)漂移，每批實(shí)驗(yàn)都要低代細(xì)胞做對(duì)照。

EBV 轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞 LCL

可長(zhǎng)期傳代，但隨傳代增加甲基化圖譜、免疫表型持續(xù)改變。

四、實(shí)驗(yàn)室實(shí)操標(biāo)準(zhǔn)（為什么大家不會(huì)無(wú)限傳）

建系后早期凍存大量低代種子庫(kù)（P5–P20）；

復(fù)蘇后只用到P50 以內(nèi)，超過(guò)代數(shù)直接丟棄；

每隔 50 代做 STR 鑒定、核型分析、功能標(biāo)志物檢測(cè)，確認(rèn)細(xì)胞沒變。