（一）血管類器官的誘導與培養步驟

1. 多能干細胞培養

1.1 細胞系：使用人類胚胎干細胞（hESC）系 H9（來自 WiCell）和誘導多能干細胞（hiPSC）系 NC8。

1.2 培養條件：

    - 在化學定義的無飼養層條件下培養，定期檢測支原體污染，確保為陰性。

    - NC8 和 H9 細胞在 E8 培養基中培養，培養皿預先用 165 µg/ml 無血清基質（GFR Matrigel）包被。

    - mTagRFPT-CAAX WTC 和 iCRISPR 409-B2 細胞在 mTesR Plus 培養基中培養，培養皿預先用 hESC 質量級 Corning Matrigel 矩陣包被。

    - 每天更換培養基，用 0.5 mM EDTA 在磷酸鹽緩沖液（DPBS）中傳代。

 2. 血管類器官（hBVO）生成

2.1 細胞聚集：

    - 用 TrypLE 處理細胞，收集后離心，重懸于聚集培養基（KnockOut DMEM/F12、20% KnockOut 血清替代品、1% GlutaMAX、1% 非必需氨基酸、55 µM β-巰基乙醇、100 U/ml 青霉素 - 鏈霉素、50 µm Y-27632）。

    - 將細胞以 100 - 300 細胞 / 微孔的密度接種于 Corning Elplasia 圓底超低附著培養皿中。

    - 形成直徑 50 - 100 µm 的聚集體后，更換為 N2B27 培養基（Neurobasal : DMEM/F12 1:1、1% B27 補充劑、0.5% N2 補充劑、0.5% GlutaMAX、55 µM β-巰基乙醇、100 U/ml 青霉素 - 鏈霉素），并添加 12 µM CHIR99021 和 30 ng/ml BMP4。

2.2 中胚層誘導及分化：

    - 第 3 天，更換為含 2 µm Forskolin 和 100 ng/ml VEGF-A 的 N2B27 培養基。

    - 第 5 天，將聚集體嵌入 Collagen I-Matrigel 溶液（由 11.3% v/v 0.1 N NaOH、4.7% v/v 10X DMEM、0.9% v/v HEPES 緩沖液、0.7% v/v NaHCO3、0.5% v/v GlutaMAX、6.9% v/v Ham’s F12、50% v/v PureCol、25% v/v GFR Matrigel 組成，pH 7.4）中，轉移到 12 孔板中。

    - 從此時起，血管網絡和類器官在 BVO 培養基（StemPro-34 SFM 培養基，添加 StemPro-34 營養補充劑、1% GlutaMAX、100 U/ml 青霉素 - 鏈霉素、15% 胎牛血清、100 ng/ml VEGF-A 和 100 ng/ml FGF2）中培養，每 2 - 3 天更換新鮮培養基。

    - 第 10 天，將含有血管網絡的凝膠置于培養皿蓋上，在立體顯微鏡下用 27G 針頭手動切取單個血管類器官，轉移到 96 孔超低附著培養皿中繼續培養。

（二）血管類器官疾病建模及移植步驟

1. 基因編輯

    - 利用CRISPR/Cas9技術對多能干細胞進行基因編輯，引入與血管疾病相關的突變。

    - 將編輯后的細胞進行篩選和擴增，獲得穩定表達突變基因的細胞系。

2. 類器官誘導與培養: 按照上述血管類器官的誘導與培養步驟，從基因編輯后的多能干細胞中誘導形成血管類器官。

3. 疾病表型分析

    - 通過免疫熒光染色、基因表達分析等方法，檢測類器官中與疾病相關的分子和細胞表型。

    - 觀察血管類器官的形態、功能以及細胞間的相互作用，評估疾病模型的相似性和可靠性。

4. 藥物篩選與驗證

    - 將不同藥物添加到疾病模型類器官的培養基中，觀察藥物對疾病表型的影響。

    - 通過高通量篩選技術，快速評估多種藥物的療效和潛在機制。

5. 移植模型評估

    - 將攜帶疾病突變的血管organoids 到免疫缺陷小鼠體內，觀察其在體內的生長、分化和功能。

    - 通過組織學分析和功能測試，評估移植后類器官的成熟度和疾病相關表型。

（三）原作者重要研究結論

Marina T. Nikolova et al.cell. 2025 Apr 16:S0092-8674(25)00387-3.

通過多種實驗技術，對人血管類器官（hBVO）的發育進行深入研究，在糖尿病模型、腦血管研究等方面取得重要結論，為理解血管發育和相關疾病機制提供關鍵依據。

 1. hBVO發育過程中的細胞命運和狀態轉變：研究利用單細胞轉錄組學等技術，詳細解析hBVO發育軌跡。發現從多能干細胞開始，經側板中胚層階段，細胞逐漸分化為內皮細胞和壁細胞。其中，內皮細胞發育存在兩個分支，早期內皮祖細胞（EPCs）在第4天出現，其ETV2表達峰值明顯，之后逐漸分化，而晚期EPCs主要出現在第14 - 21天，且不表達ETV2 。同時，研究還證實了hBVO壁細胞具有分化為內皮細胞的潛能，豐富了對血管細胞發育的認知。 

2. 糖尿病模型：文中構建hBVO模擬糖尿病血管病變。研究表明，hBVO在模擬糖尿病環境下，血管結構和細胞組成發生顯著變化，與體內糖尿病血管病變特征相似。通過對相關信號通路的研究發現，VEGF和Notch信號通路對hBVO的發育和血管生成至關重要。在糖尿病狀態下，這些信號通路的異常激活或抑制，會影響內皮細胞的分化、增殖和血管的穩定性，進而導致血管功能障礙。這為深入研究糖尿病血管病變的發病機制提供了重要的體外模型，有助于開發針對糖尿病血管并發癥的治療策略 。 

• 在模擬糖尿病環境下，hBVO 的血管結構和細胞組成出現與體內糖尿病血管病變相似的顯著變化，且 VEGF 和 Notch 等信號通路異常。這啟示我們，深入探究這些信號通路的具體調控機制，明確它們在糖尿病血管病變中的關鍵節點，將有助于揭示糖尿病血管并發癥的發病根源，為開發精準治療策略提供理論支撐。例如，針對 VEGF 和 Notch 信號通路的異常變化，可以研發特異性的抑制劑或激活劑，精準干預病變過程，從而改善血管功能 。
  
  
• 人血管類器官hBVO 作為有效的體外模型，可用于評估潛在藥物對糖尿病血管病變的治療效果。在實驗中，通過觀察藥物處理后 hBVO 血管結構和細胞功能的變化，能夠快速篩選出具有治療潛力的藥物，大大提高藥物研發的效率。以改善內皮細胞功能的藥物篩選為例，可在 hBVO 模型上測試不同藥物對內皮細胞分化、增殖和血管生成的影響，挑選出的藥物進行進一步研究和臨床試驗，縮短藥物研發周期，降低研發成本 。

3. 腦血管研究：在腦血管研究中，研究人員發現hBVO內皮細胞與人類胎兒胰腺的內皮細胞在轉錄組上最為相似，但與腦內皮細胞存在差異。盡管如此，與腦海綿狀毛細血管畸形相關的基因在hBVO內皮細胞中的表達高于胎兒小腦或大腦的內皮細胞。這一發現暗示，hBVO在模擬腦血管疾病方面具有一定潛力，同時也表明，雖然hBVO與腦內皮細胞存在差異，但某些疾病相關基因的表達特征可能為研究腦血管畸形的病理機制提供新線索 。通過對hBVO的研究，有助于深入理解腦血管疾病的發生發展過程，為開發針對性的治療方法提供理論基礎。 

4. 其他重要結論：通過對hBVO進行基因擾動實驗，明確了多個轉錄因子和受體在血管發育中的關鍵作用。例如，ETV2對內皮細胞發育，MECOM雖在hBVO的內皮細胞中高表達，但并非內皮細胞發育所必需，而是對造血細胞和某些壁細胞亞型的分化具有指導作用 。此外，研究還發現hBVO移植到免疫缺陷小鼠后，內皮細胞可進一步成熟并獲得動脈或靜脈樣表型，且壁細胞在體內可分化為多種間充質起源的細胞，這為研究血管發育后期階段以及細胞治療提供了重要信息 。 

(四) 創 新 展 望

 4.1 血管類器官的動態培養與成熟

1. - 提升類器官成熟度：Kirkstall Quasi Vivo系統 能夠模擬體內微環境的動態條件，如血流、氧氣梯度和營養物質的實時交換，這有望促進hBVO在體外的進一步成熟。通常hBVO在體外培養時未能wan quan獲得明確的動脈-靜脈內皮身份，而動態培養條件可能有助于改善這一局限，使類器官在體外就能更接近體內血管的分化和成熟狀態。

   
   

2. - 增強細胞功能與相互作用：動態系統可以增強內皮細胞和壁細胞之間的相互作用，模擬體內血管的生理功能，如血管收縮和舒張。這種動態培養環境可能使hBVO中的細胞展現出更接近體內的功能特性，例如內皮細胞的屏障功能、壁細胞對血管穩定性的調節作用等，從而為研究血管功能和疾病機制提供更準確的模型。

4.2 多器官芯片系統中的血管網絡構建

1. - 構建復雜的血管網絡：Kirkstall Quasi Vivo系統允許將多個類器官或不同的組織類型整合在一起，模擬人體不同器官之間的連接和相互作用。結合hBVO，可以構建包含多個血管分支的復雜血管網絡，模擬人體內不同器官的血液供應和循環系統，這對于研究器官間的物質交換、藥物分布以及疾病傳播等具有重要意義。

   
   

2. - 研究器官間的相互影響：通過將hBVO與其他器官類器官（如肝臟、腎臟、心臟等）在Kirkstall Quasi Vivo系統中進行共培養，可以研究血管系統與其他器官之間的相互影響。例如，觀察血管類器官在不同器官微環境中的適應性變化，以及器官病變對血管系統的影響，從而深入了解多器官疾病的發生發展機制和全身性的病理生理變化。

   
   

   4.3 疾病建模與藥物篩選
   

3. - 更精準的疾病模型：將攜帶特定血管疾病基因突變的hBVO置于Kirkstall Quasi Vivo系統的動態環境中，可以更好地模擬疾病發生發展的復雜過程。這種動態疾病模型能夠更準確地反映體內疾病的病理生理特征，為研究疾病的分子機制提供更可靠的平臺，有助于發現新的疾病標志物和治療靶點。

   
   

4. - 高通量藥物篩選：Kirkstall Quasi Vivo系統的微流控設計和模塊化結構使其具備高通量篩選的潛力。結合hBVO，可以在該系統中快速測試大量藥物對血管類器官的影響，評估藥物的療效和安全性。同時，動態培養條件能夠實時監測藥物對血管功能的動態影響，為藥物研發提供更全面的評估信息，加速血管相關疾病的藥物發現進程。

公司主營產品：

Kilby 3D-clinostat 三維旋轉儀，

Kilby 微/超重力細胞旋轉培養系統，

3D回轉重力環境模擬系統，隨機定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall 類器官串聯芯片灌流仿生構建系統