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一、研究背景與意義

（一）疾病現狀與治療需求

2 型糖尿病患者數量逐年增加，胰島素抵抗是其核心特征，會損害血液中葡萄糖的攝取，導致血糖升高，進而引發心血管疾病、糖尿病視網膜病變、外周動脈疾病等并發癥。

控制血糖水平對 2 型糖尿病治療至關重要，而骨骼肌作為關鍵器官，在健康人群中吸收 70%-90% 的餐后血糖，同時通過釋放肌聯素、鳶尾素等激素維持血糖穩態，因此改善骨骼肌葡萄糖攝取是治療胰島素抵抗的重要策略。

（二）傳統篩選方法的局限性

1. 2D 細胞培養缺陷

傳統 2D 細胞培養無法精準復刻體內復雜的結構和生理特征，在藥物篩選和疾病建模中預測可靠性低。例如 2D 成肌細胞模型中胰島素倍數變化過低，難以有效篩選藥物，且體外培養結果向體內藥效評估轉化時存在 reproducibility（可重復性）問題，阻礙新藥研發。

2. 動物實驗倫理爭議

多國倫理限制使藥物篩選中動物的使用減少，急需替代方法評估藥物療效和毒性，以滿足倫理要求并推動藥物研發進程。

（三）3D 細胞培養的優勢

3D 細胞培養系統（如球體共培養模型、類器官、Kirkstall Quasi Vivo串聯式類器官芯片）能更好地模擬活體細胞活動，在藥物療效和毒性評估中結果更接近體內研究，有望成為 2D 細胞培養和動物實驗的理想替代方案，為 2 型糖尿病藥物篩選提供更優平臺。

二、研究方法

（一）細胞培養

1.細胞來源與基礎培養

使用從美國典型培養物保藏中心獲取的 C2C12 細胞系，培養在添加 10% 熱滅活胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素的杜氏改良 eagle 培養基（DMEM）中，當細胞融合度達 70%-80% 時，更換為含 2% 馬血清的培養基誘導分化。

2. 3D 細胞培養構建

將細胞與 I 型膠原蛋白（Advanced BioMatrix）和海藻酸鹽（Sigma - Aldrich）混合，在 37℃、5% CO?培養箱中孵育 15-20 分鐘，隨后用 18 號針頭注射器滴入 1% CaCl?溶液使其固化，經兩次 DMEM 清洗后，在含 10% FBS 的 DMEM 中孵育過夜穩定結構，最后更換為含 2% 馬血清的培養基誘導肌細胞分化，構建流程如圖 1 所示。

（二）關鍵檢測與分析方法

1. Western blot 分析

用 DPBS 清洗樣本，在含 PhosSTOP EASY Pack 磷酸酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀測定緩沖液中勻漿提取蛋白質，15000g、4℃離心 10 分鐘后，通過 BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。

取 20mg 蛋白上樣至 Bolt 迷你凝膠，轉移到 iBlot 凝膠轉移堆疊聚偏二氟乙烯膜，用酪蛋白緩沖液或 5% 牛血清白蛋白（BSA）封閉后，與肌球蛋白重鏈（MHC）、葡萄糖轉運蛋白 4（GLUT4）、p - Akt、Akt 和 β - 肌動蛋白的一抗孵育，最后用化學發光法（Bio - Rad）顯影。

2. 細胞活力檢測

采用 Live/Dead 檢測試劑盒（Invitrogen）和 CCK - 8 檢測（Dojindo Molecular Technologies）。Live/Dead 檢測中，3D 支架按說明書用鈣黃綠素 AM（活細胞染綠）和乙錠同源二聚體 - 1（死細胞染紅）在 37℃黑暗環境下孵育 30 分鐘；

CCK - 8 檢測中，向培養基加入終濃度 10% 的 CCK - 8 溶液，在 CO?培養箱孵育 1 小時后，用酶標儀在 450nm 處測吸光度。

3. 葡萄糖攝取檢測

使用葡萄糖類似物 2 - NBDG（Thermo Fisher Scientific）。分化 4 天后，先在含 2% 馬血清的低葡萄糖 DMEM 中培養 32 小時，再在含 2% BSA 和棕櫚酸（PA）的低葡萄糖 DMEM 中培養 16 小時，藥物在轉換到低葡萄糖培養基時加入。

2D 培養細胞用 DPBS 清洗后，在無葡萄糖 DMEM 中加入 200nM 胰島素和 200μM 2 - NBDG 處理 20 分鐘；

3D 培養細胞清洗 2 - 3 次后用 20mM 乙二胺四乙酸溶液溶解 10 分鐘，離心后同樣在無葡萄糖 DMEM 中加入上述試劑處理 20 分鐘，最后用 DPBS 清洗 3 - 4 次，在 465/540nm 處測熒光值，并用 FluoReporterBlue 熒光 dsDNA 定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific）檢測雙鏈 DNA 濃度對熒光值歸一化。

4.小鼠比目魚肌葡萄糖攝取檢測

實驗方案經韓國化學技術研究院機構動物護理和使用委員會批準，選用 10-11 周齡雄性 C57BL/6 小鼠，麻醉后分離后肢比目魚肌，用 Krebs - Ringer 碳酸氫鹽緩沖液清洗，在 CO?培養箱中用 400nM 胰島素孵育 30 分鐘，再加入 200mM 2 - NBDG 處理 20 分鐘，研磨組織后在 465/540nm 處測熒光值，通過 dsDNA 歸一化。

5.統計分析

結果以平均值 ± 標準誤（S.E.M.）表示，用 GraphPad Prism 軟件分析，采用多重 t 檢驗或單因素方差分析結合 Tukey 多重比較檢驗判斷顯著性，p<0.05 為差異有統計學意義。

三、實驗結果

（一）3D 細胞培養條件優化

1.支架成分優化

比較不同濃度海藻酸鹽（0.75%-1.25%）和 I 型膠原蛋白（0.5-1.5mg/mL）組合，發現 1% 海藻酸鹽 + 1mg/mL 膠原蛋白的組合能形成最均勻的 3D 形態，且 MHC、GLUT4 和 p - Akt 表達水平高，該組合能為肌肉分化和葡萄糖攝取研究提供適宜的 3D 環境。

2. 細胞接種密度優化

在 3D 培養條件下，5×10?細胞 /mL 僅在培養初期維持增殖，約第 6 天出現細胞死亡；1×10?細胞 /mL 可增殖至第 8 天，之后維持活力無進一步增殖，且 Live/Dead 檢測顯示 14 天內幾乎所有細胞存活。在分化條件下，1×10?細胞 /mL 和 5×10?細胞 /mL 的細胞活力穩定，綜合選擇 1×10?細胞 /mL 作為后續實驗的接種密度。

（二）2D 與 3D 培養系統葡萄糖攝取效率對比

分化 4 天和 8 天后，用 200nM 胰島素處理細胞檢測 2 - NBDG 攝取。2D 培養中，分化 4 天胰島素處理組葡萄糖攝取倍數變化不足 1.5 倍，8 天時細胞狀態差，葡萄糖攝取無明顯變化；

而 3D 培養中，胰島素處理組在分化 4 天和 8 天的 2 - NBDG 攝取均增加約 3 倍，表明 3D 培養中細胞對胰島素激活的葡萄糖攝取響應顯著優于 2D 培養。

（三）棕櫚酸（PA）誘導胰島素抵抗模型建立

1. PA 濃度篩選

PA 作為飽和脂肪酸可直接誘導胰島素抵抗，用 0.2-1mM PA 處理分化的 C2C12 細胞 16 小時，發現 PA 濃度超過 0.4mM 時細胞活力顯著下降，故后續 2 - NBDG 攝取實驗選用低于 0.2mM 的 PA 濃度以保證細胞活力。

2.藥物驗證模型

用羅格列酮（過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 激動劑）和二甲雙胍（腺苷一磷酸激活蛋白激酶激活劑）驗證模型。分化 4 天的細胞經 0.1-0.2mM PA 處理 16 小時后加胰島素，2D 和 3D 模型中胰島素處理組 2 - NBDG 攝取均增加，但 0.1mM PA + 胰島素處理組無顯著增加。

10μM 羅格列酮在 0.1mM PA + 胰島素組中可顯著提高 2 - NBDG 攝取，在 0.15 或 0.2mM PA + 胰島素組中無改善，因此后續藥物測試選用 0.1mM PA。進一步用 1、10、30μM 的羅格列酮和二甲雙胍處理 48 小時，兩種模型中葡萄糖攝取均呈濃度依賴性增加，且 3D 培養模型中 2 - NBDG 攝取倍數變化更顯著。

（四）基于韓國藥物庫的篩選結果

對韓國藥物庫提供的 165 種藥物，以 30μM 羅格列酮和二甲雙胍為陽性對照進行篩選，在 2D 培養中篩選出 2 種有效藥物，3D 培養中篩選出 3 種有效藥物。對在兩種培養系統中均有效的 5 種 “命中" 藥物進行濃度依賴性葡萄糖攝取分析，2D 有效藥物在 2D 模型中呈濃度依賴性增加葡萄糖攝取，3D 有效藥物在 3D 模型中表現類似。

Marker 分析顯示，2D 有效藥物在 2D 模型中提高 p - Akt 表達，3D 有效藥物在 3D 模型中提高 p - Akt 表達，且 MHC 表達無顯著變化。小鼠比目魚肌葡萄糖攝取實驗中，3D 培養中有效的 3 種藥物比 2D 培養中有效的藥物更能顯著提高葡萄糖攝取，證明 3D 模型結果更接近體內實驗。

四、討論

（一）3D 模型的優勢與創新

1.生理相關性提升

3D 人工肌肉模型采用 C2C12 成肌細胞，結合 1% 海藻酸鹽和 1mg/mL I 型膠原蛋白構建支架，模擬體內骨骼肌微環境。海藻酸鹽生物相容性高、多孔且易分解，便于營養擴散和分析；

I 型膠原蛋白作為細胞外基質主要成分，為細胞提供結構支撐和信號提示，使模型在肌肉分化（MHC 表達）和葡萄糖代謝（GLUT4、p - Akt 表達）相關標志物上更接近體內狀態，解決 2D 模型無法復刻體內復雜生理特征的問題。

2.藥物篩選效能優化

3D 模型中胰島素誘導的葡萄糖攝取倍數（約 3 倍）顯著高于 2D 模型（不足 1.5 倍），能更靈敏檢測藥物對胰島素抵抗的改善效果。在 165 種藥物篩選中，3D 模型篩選出的有效藥物在小鼠比目魚肌實驗中表現更優，說明該模型能更準確預測體內藥物療效，減少 2D 模型到體內實驗的轉化差異，提高藥物篩選可靠性。

3.倫理與實用性兼顧

3D 模型作為動物實驗替代方案，符合多國倫理限制，同時可實現高通量篩選，且培養條件穩定（14 天內細胞活力良好），操作流程標準化（如支架構建、檢測方法統一），便于推廣應用于早期藥物研發。

（二）研究局限性與未來方向

1. 局限性

2. 模型僅聚焦骨骼肌細胞，未包含脂肪、肝臟等其他參與葡萄糖穩態的器官細胞，無法模擬多器官間的代謝交互作用；雖在小鼠比目魚肌實驗中驗證有效性，但缺乏人體組織樣本驗證，可能存在物種差異影響臨床轉化。

3. 未來方向

4. 可構建多細胞共培養的 3D 模型，整合脂肪細胞、肝細胞等，更全面模擬體內代謝網絡；進一步結合類器官、北京基爾比生物科技公司Kirkstall Quasi Vivo 串聯式器官芯片技術，提升模型的生理復雜度和功能完整性；開展臨床樣本驗證研究，建立模型與人體藥效的關聯，推動模型在臨床前藥物評估中的應用。

五、研究結論

Ki Young Kim，博士，TISSUE ENGINEERING: Part C，2025 年第 31 卷第 2 期

本研究成功開發了一種基于 3D 肌肉細胞培養的胰島素抵抗模型，通過優化支架成分（1% 海藻酸鹽 + 1mg/mL I 型膠原蛋白）和細胞接種密度（1×10?細胞 /mL），該模型在肌肉分化標志物表達和葡萄糖攝取響應上顯著優于傳統 2D 模型。

經 PA 誘導胰島素抵抗后，模型能有效區分藥物療效，在韓國藥物庫 165 種藥物篩選中，3D 模型篩選出的有效藥物在小鼠比目魚肌實驗中與體內結果更一致。

該 3D 模型為 2 型糖尿病藥物篩選提供了生理相關性更高、可靠性更強的平臺，同時符合倫理要求，有望加速 2 型糖尿病新藥研發進程。