腸道類器官免疫共培養，研究HIV感染者腸道屏障破壞新機制

（一） 腸類器官（Colonoid）培養

實驗目的：通過建立腸類器官模型，模擬人體腸道上皮細胞的生長和分化過程，研究腸道上皮細胞的生理和病理變化，特別是腸道上皮細胞凋亡情況。

具體詳細步驟

1. 組織樣本收集

從接受結腸鏡檢查的健康個體和HIV感染者（PWH）中獲取結腸活檢樣本。

活檢樣本立即放入含有RPMI培養基的容器中，培養基中添加了抗生素（如哌拉西林/他唑巴坦、兩性霉素B、青霉素、鏈霉素）和10%胎牛血清（FBS）以及2 mM L-谷氨酰胺，以防止污染。

2. 隱窩分離

將活檢樣本在含有10 mM EDTA的PBS中孵育30分鐘，以分離上皮細胞。

通過機械方法（如輕輕拍打）將隱窩從組織中分離出來。

使用70 μm細胞篩過濾細胞懸液，以去除未分離的組織碎片。

將分離出的隱窩離心（100g，3分鐘），去除上清液。

3. 類器官培養

將隱窩重懸于Matrigel（Corning）中，每孔20 μL Matrigel中嵌入10個隱窩。 將Matrigel滴液置于48孔板中，室溫下靜置30分鐘，使Matrigel凝固。在Matrigel上方加入預熱的類器官培養基，培養基成分包括：

L-WRN細胞條件培養基（L-WRN CM）：收集L-WRN細胞培養8天的上清液，稀釋1:1后使用。

- 補充成分：1X B27（Gibco）、10 μM煙酰胺（Sigma Aldrich）、50 ng/mL EGF（PeproTech）、500 nM A83-01（Cayman Chemical）、10 μM SB202190（Cayman Chemical）、500 nM PGE2（Cayman Chemical）。

在37°C、5% CO2的培養箱中培養類器官，定期更換培養基。

4. 類器官傳代

當類器官生長到一定大小后，使用TrypLE（Thermo Fisher Scientific）將其從Matrigel中分離出來。 將分離出的類器官重懸于Matrigel中，重新嵌入新的Matrigel滴液中，繼續培養。

5. 類器官的使用

用于共培養實驗：將類器官與免疫細胞共培養，評估免疫細胞對類器官上皮細胞的影響。

用于屏障功能檢測：通過FITC-葡聚糖微注射實驗評估類器官的屏障完整性。

6. 類器官模型的驗證：

通過類器官模型，研究者觀察到PWH的類器官中上皮細胞凋亡顯著增加，與體內觀察結果一致。通過FITC-葡聚糖微注射實驗，發現PWH的類器官屏障功能受損，表現為FITC-葡聚糖泄漏增加。

（二）免疫細胞共培養

實驗目的：評估PWH的結腸免疫細胞（特別是CD8+ T細胞）對腸道上皮細胞凋亡的影響。建議可使用Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯共培養動態灌流系統。

具體實驗步驟

1. 免疫細胞分離

從PWH和健康對照組的結腸活檢樣本中分離免疫細胞。

使用密度梯度離心法從外周血中分離PBMCs。

從結腸活檢樣本中分離淋巴細胞，包括上皮內淋巴細胞（IELs）和固有層（LP）細胞。

使用磁珠分選技術（Miltenyi CD45微珠）富集CD45+免疫細胞。

2. 免疫細胞培養

將分離出的免疫細胞在含有10% FBS的完RPMI培養基中培養。

- 添加細胞因子（如50 IU/mL人IL-2、10 ng/mL人IL-7、10 ng/mL人IL-15）以維持細胞的活性和增殖。

- 培養48小時后，收集細胞用于共培養實驗。

3. 共培養設置

直接共培養：將100,000個免疫細胞與20個類器官混合，嵌入70% Matrigel和30% PBS中，每孔24孔板中加入20 μL混合物。

Transwell共培養：將100,000個免疫細胞種植在24孔Transwell系統的底部培養基中，將類器官嵌入Matrigel中并置于Transwell插件中。

上清液共培養：將免疫細胞的培養上清液加入類器官培養基中，評估可溶性因子的影響。

4. 共培養條件

在37°C、5% CO2的培養箱中培養共培養體系。定期更換培養基，確保細胞的生長和活性。

5. 評估指標

細胞凋亡：通過流式細胞術檢測上皮細胞表面標志物（如Epcam）和凋亡標志物（如cleaved caspase 3）的表達。

屏障功能：通過FITC-葡聚糖微注射實驗評估類器官的屏障完整性。

細胞接觸：使用共聚焦顯微鏡觀察免疫細胞與上皮細胞的接觸情況。

6. 免疫細胞的作用：

通過共培養實驗，研究者發現PWH的結腸CD8+ T細胞能夠誘導類器官上皮細胞凋亡，而這種凋亡主要依賴于CD8+ T細胞與上皮細胞的直接接觸。

通過添加PPARγ激動劑rosiglitazone，可以恢復PWH的CD8+ T細胞的脂質代謝，減少上皮細胞凋亡，表明PPARγ信號通路在維持腸道屏障功能中的關鍵作用。

（三）研究意義

這些實驗方法和結果為理解HIV感染者腸道屏障完整性受損的機制提供了重要線索，并為開發新的治療策略提供了科學依據。

通過腸類器官培養和免疫細胞共培養實驗，研究者能夠模擬體內環境，深入研究PWH腸道上皮細胞凋亡的機制，并探索潛在的治療靶點。

這些發現有助于減少HIV感染者因腸道屏障功能障礙導致的并發癥，提高其生活質量。

Kirkstall Quasi Vivo®類器官串聯3D灌流共培養系統