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一、引言

1. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）特性

CNS 是人體結(jié)構(gòu)和功能最復(fù)雜的系統(tǒng)，以神經(jīng)組織為基本組織，主要由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。這些細(xì)胞以極其精密且高度復(fù)雜的方式結(jié)合，形成具有三維（3D）結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)。通過(guò)神經(jīng)元或其他細(xì)胞間復(fù)雜有序的連接，形成各類神經(jīng)傳導(dǎo)通路和神經(jīng)回路，調(diào)控器官系統(tǒng)功能活動(dòng)，維持機(jī)體與外界環(huán)境的統(tǒng)一。

2. 傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)的局限性

傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)僅包含單一細(xì)胞類型，且脫離了體內(nèi)自然復(fù)雜的生長(zhǎng)環(huán)境，細(xì)胞特性趨于簡(jiǎn)單，原始生物學(xué)特性逐漸喪失，導(dǎo)致其生理或代謝特性與體內(nèi)天然菌株或細(xì)胞不同，無(wú)法探究多細(xì)胞系統(tǒng)間的相互關(guān)系。

而細(xì)胞生存的微環(huán)境中，細(xì)胞間需要信息交換和物質(zhì)代謝，細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為至關(guān)重要，研究不同類型細(xì)胞間的通訊機(jī)制對(duì)理解某些疾病的病理機(jī)制意義重大。

3. 共培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)與用途

細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)能在很大程度上模擬體內(nèi)環(huán)境，便于觀察細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境間的相互作用，通過(guò)檢測(cè)不同細(xì)胞因子間的關(guān)系，探究藥物作用機(jī)制及潛在靶點(diǎn)。

共培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使在體外闡明神經(jīng)細(xì)胞間的相互作用、重現(xiàn)復(fù)雜神經(jīng)回路成為可能，可用于研究細(xì)胞分化、細(xì)胞功能與活力、細(xì)胞增殖與遷移、CNS 發(fā)育以及代謝機(jī)制等。相較于動(dòng)物模型，體外共培養(yǎng)模型能更便捷、精準(zhǔn)地揭示細(xì)胞、組織或器官間相互作用的深層機(jī)制。

二、2D 共培養(yǎng)模型在神經(jīng)細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用研究中的應(yīng)用

2D 共培養(yǎng)模型可觀察細(xì)胞間或細(xì)胞與其周圍微環(huán)境的相互作用，主要分為直接接觸共培養(yǎng)和間接接觸共培養(yǎng)兩類。

1. 直接接觸共培養(yǎng)模型

• 細(xì)胞混合共培養(yǎng)

將兩種或多種細(xì)胞按一定比例混合，在特定條件下接種到同一界面。其是能清晰展示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞間的相互作用，例如神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的因子可促進(jìn)人 NSCs 向多巴胺能神經(jīng)元分化；與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn) NSCs 向神經(jīng)元分化。此外，還可向共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加免疫細(xì)胞因子等調(diào)控因子研究細(xì)胞間相互作用，如向包含原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)系統(tǒng)中添加白細(xì)胞介素 33（IL-33），發(fā)現(xiàn) IL-33 可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，從而降低共培養(yǎng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的死亡率。

• 飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)

將細(xì)胞接種在特定細(xì)胞（如顆粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞等）形成的單層上，飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)有絲分裂抑制劑（常用）處理后，雖失去分裂能力，但仍保留分泌生長(zhǎng)因子的能力。某些細(xì)胞的存活和增殖依賴飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，飼養(yǎng)層可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，抑制細(xì)胞分化，這在胚胎干細(xì)胞（ESCs）培養(yǎng)中尤為明顯，且該系統(tǒng)中多種細(xì)胞類型間更易形成細(xì)胞連接。在此基礎(chǔ)上，還建立了由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞組成的三培養(yǎng)系統(tǒng)，能更真實(shí)地模擬體內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，助力理解細(xì)胞間通訊對(duì)神經(jīng)炎癥的影響。

2. 間接接觸共培養(yǎng)模型

細(xì)胞間的相互作用或調(diào)控不僅依賴直接接觸，更多通過(guò)微環(huán)境中釋放的化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)，因此需要避免細(xì)胞直接接觸的共培養(yǎng)系統(tǒng)。間接接觸共培養(yǎng)是將兩種或多種不同類型細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞通過(guò)培養(yǎng)基中的化學(xué)因子相互作用，而無(wú)物理直接接觸，主要實(shí)現(xiàn)方式有以下三種：

• 條件培養(yǎng)基

收集含有細(xì)胞分泌的多種生長(zhǎng)因子或刺激物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于研究這些因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)或分化的影響。例如，收集經(jīng)不同時(shí)長(zhǎng)缺氧處理的神經(jīng)元的條件培養(yǎng)基，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)不同表型。

• 蓋玻片上的飼養(yǎng)細(xì)胞

將分泌特定因子的細(xì)胞接種在蓋玻片上，避免與培養(yǎng)皿中接種的細(xì)胞直接接觸。該方法適用于研究特定條件下細(xì)胞的旁分泌作用，且可進(jìn)行定量分析。

• Transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)

由于具有可重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)化和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)在間接細(xì)胞間相互作用研究中被廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。例如，通過(guò) Transwell 方法共培養(yǎng)施萬(wàn)細(xì)胞（SCs）和神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn) SCs 分泌的 β- 細(xì)胞素可影響神經(jīng)元行為，增加突觸長(zhǎng)度，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)再生。

3. 2D 共培養(yǎng)模型的局限性

盡管科研人員嘗試在 2D 條件下重現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境，但體內(nèi)細(xì)胞處于具有特定空間結(jié)構(gòu)的 3D 環(huán)境中，該環(huán)境會(huì)影響細(xì)胞行為，因此 2D 共培養(yǎng)條件下獲得的數(shù)據(jù)可能與體內(nèi)結(jié)果存在顯著差異。2D 培養(yǎng)中細(xì)胞的生長(zhǎng)模式、形態(tài)和功能與體內(nèi)生理?xiàng)l件下明顯不同，細(xì)胞呈扁平生長(zhǎng)狀態(tài)，分裂異常，還可能喪失分化表型，這種異常的細(xì)胞形態(tài)會(huì)影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白質(zhì)表達(dá)等多種細(xì)胞過(guò)程。

三、3D 共培養(yǎng)模型在神經(jīng)細(xì)胞相互作用研究中的應(yīng)用

3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)因能模擬體內(nèi)環(huán)境，為研究復(fù)雜神經(jīng)細(xì)胞相互作用（如各類神經(jīng)細(xì)胞間的協(xié)同作用和保護(hù)作用）提供了可靠方法。3D 共培養(yǎng)技術(shù)可展示細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)表達(dá)等細(xì)胞活動(dòng)和細(xì)胞間反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)真實(shí)的細(xì)胞生物學(xué)功能研究。本文將 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)分為基于細(xì)胞的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)、基于組織切片的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)和基于類器官的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)。

1. 基于細(xì)胞的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)

• 構(gòu)建原理

為構(gòu)建模擬體內(nèi)結(jié)構(gòu)的 3D 架構(gòu)，可將神經(jīng)細(xì)胞包埋在凝膠化后具有特定 3D 結(jié)構(gòu)的水凝膠中。天然水凝膠和合成水凝膠均已用于 3D 系統(tǒng)的生物工程構(gòu)建，但這些生物材料會(huì)對(duì)細(xì)胞行為（如細(xì)胞活力、增殖、遷移或分化）產(chǎn)生額外影響，這可能與水凝膠的生物力學(xué)特性以及材料 - 細(xì)胞相互作用有關(guān)。

• 常用水凝膠類型及應(yīng)用

Matrigel

作為一種天然水凝膠，Matrigel 對(duì)維持細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化以及軸突延伸具有積極作用。然而，源于小鼠的 Matrigel 由于成分不確定且具有腫瘤來(lái)源，無(wú)法應(yīng)用于臨床。

膠原水凝膠

除 Matrigel 外，膠原水凝膠對(duì)神經(jīng)譜系細(xì)胞也具有類似作用。例如，Yang 等人研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物與膠原水凝膠聯(lián)合處理可誘導(dǎo)原位內(nèi)源性 NSCs 向神經(jīng)元分化，并恢復(fù)受損功能。

海藻酸鹽

另一種天然水凝膠海藻酸鹽，因結(jié)構(gòu)與腦內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分透明質(zhì)酸相似，也被用作構(gòu)建 3D 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的潛在生物材料。海藻酸鹽是從海帶或褐藻的馬尾藻中提取碘和甘露醇的副產(chǎn)品，其水溶液具有高黏度，常用作食品增稠劑、穩(wěn)定劑和乳化劑。Moxon 等人將海藻酸鹽和膠原混合，制備出模擬腦 ECM 某些特性的定制水凝膠，研究發(fā)現(xiàn)包埋其中的人多能干細(xì)胞（hPSCs）來(lái)源的神經(jīng)元能黏附在水凝膠基質(zhì)上，并形成 3D 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

水凝膠復(fù)合材料

近年來(lái)研究表明，Matrigel、海藻酸鹽等天然材料可通過(guò)設(shè)計(jì)、合成形成水凝膠復(fù)合材料，進(jìn)而制備具有多孔或特定排列結(jié)構(gòu)的支架。這些結(jié)構(gòu)能為 3D 支架上的接種細(xì)胞提供所需的生物力學(xué)支撐，并創(chuàng)造優(yōu)化條件，促進(jìn)功能性組織的形成。例如，Primo 等人利用具有特定排列的功能化單壁碳納米管基海藻酸鹽復(fù)合凝膠，建立了一種制備用于細(xì)胞治療和其他應(yīng)用的導(dǎo)電基質(zhì)的新方法。

在另一項(xiàng)研究中，將成年 NSCs 培養(yǎng)在碳納米管（CNT）- 水凝膠復(fù)合材料上，優(yōu)化后的生物力學(xué)支撐提高了神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例，并誘導(dǎo)形成更高的突觸連接性，表明水凝膠復(fù)合材料有望成為兼具高導(dǎo)電性和生物相容性的材料，用于促進(jìn)神經(jīng)再生。

脫細(xì)胞組織基質(zhì)（DTM）

脫細(xì)胞組織基質(zhì)（DTM）是開發(fā)個(gè)性化臨床方法的另一種有前景的支架，在促進(jìn)神經(jīng)組織再生方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其是源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 DTM。Xu 等人對(duì)源于脊髓的 DTM 水凝膠（DSCM - gel）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) DSCM - gel 保留了類 ECM 的納米纖維結(jié)構(gòu)，且具有更高的孔隙率，在 3D 培養(yǎng)中能增強(qiáng) NSCs / 神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）的活力、增殖、遷移和神經(jīng)元分化。

總結(jié)與注意事項(xiàng)

水凝膠支架易于支持 3D 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，支架的多孔結(jié)構(gòu)有利于氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，使細(xì)胞能在支架網(wǎng)絡(luò)內(nèi)增殖、遷移，并最終黏附在支架網(wǎng)絡(luò)上（具體案例見表 1）。但需控制通過(guò)該技術(shù)獲得的球體大小，因?yàn)檩^大的 3D 球體會(huì)因缺乏營(yíng)養(yǎng)而導(dǎo)致中心壞死。

表 1 基于細(xì)胞的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)案例

2. 基于組織切片的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)

• 發(fā)展歷程

器官型腦切片培養(yǎng)技術(shù)最早于 20 世紀(jì) 60 年代發(fā)展起來(lái)，1991 年 Stoppini 等人將腦切片培養(yǎng)作為神經(jīng)科學(xué)研究的新模型引入，至今已被廣泛用作體外模型，用于研究神經(jīng)發(fā)育和再生的多個(gè)方面，如細(xì)胞增殖、凋亡、胚胎皮質(zhì)形成以及神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的遷移 / 侵襲等（具體案例見表 2）。

• 優(yōu) 勢(shì)

保留體外系統(tǒng)優(yōu)勢(shì): 組織切片保留了體外系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)了細(xì)胞系功能缺失的不足，在一定程度上維持了組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織活性和器官功能，為神經(jīng)分化和神經(jīng)回路形成提供了有利的微環(huán)境。例如，Wang 等人通過(guò)將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）與人胎兒小腦切片共培養(yǎng)，成功誘導(dǎo) iPSCs 分化為具有電生理功能的浦肯野細(xì)胞；研究還表明，牙髓干細(xì)胞（DPSCs）在器官型切片共培養(yǎng)系統(tǒng)中可分化為神經(jīng)元。

研究血管系統(tǒng)與 CNS 的關(guān)系: 器官型切片的另一優(yōu)勢(shì)是保留了生理狀態(tài)下血管系統(tǒng)的 3D 排列。血管系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在功能上的相互依賴，因此腦切片可作為研究血管系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)分化和發(fā)育影響的理想模型。例如，將胚胎干細(xì)胞（ESCs）與海馬切片共培養(yǎng)，ESCs 會(huì)分化為神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）并遷移到海馬切片的血管上，而血管相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子 CXCL12 在這一遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

疾病模型研究: 將器官型切片與共培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，對(duì)研究各種神經(jīng)通路和疾病模型尤為有益。例如，在缺氧缺糖條件下，海馬切片可用于模擬氧化應(yīng)激引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷；將成年全腦冠狀切片與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）共培養(yǎng)，可用于模擬膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤 - 宿主細(xì)胞相互作用，研究多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方法。

此外，腦切片還是在細(xì)胞和分子水平闡明少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）分化和髓鞘形成機(jī)制的有力工具，如 Baudouin 等人將 OPC 移植到小腦切片中研究髓鞘形成。

脊髓切片的應(yīng)用

除腦切片外，脊髓切片也廣泛應(yīng)用于神經(jīng)修復(fù)和再生等神經(jīng)科學(xué)研究。脊髓作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，是周圍神經(jīng)與大腦之間的通路，向上與延髓相連，向下通過(guò)脊神經(jīng)與周圍神經(jīng)相通。例如，有研究將大鼠脊髓切片與周圍神經(jīng)移植物共培養(yǎng)，并施加不同濃度的米諾環(huán)素，觀察其對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率的影響；為分析血管和神經(jīng)結(jié)構(gòu)之間的相互作用，

Mariya 等人將小鼠脊髓切片與主動(dòng)脈片段在體外共培養(yǎng)，結(jié)果表明神經(jīng)組織對(duì)主動(dòng)脈出芽具有顯著的積極影響，該共培養(yǎng)系統(tǒng)為進(jìn)一步研究驅(qū)動(dòng)神經(jīng)組織和內(nèi)皮組織之間復(fù)雜相互作用的機(jī)制提供了有用且有前景的模型。

• 局限性

基于切片的共培養(yǎng)系統(tǒng)雖能提供與體內(nèi)高度接近的微環(huán)境，但仍存在一定局限性，如組織切片的制備和操作過(guò)程復(fù)雜，需要相對(duì)精細(xì)的操作和經(jīng)驗(yàn)積累，且與其他體外培養(yǎng)一樣，腦切片無(wú)法重現(xiàn)體內(nèi)的生理環(huán)境。

表 2 基于組織切片的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)案例

3. 基于類器官的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)

• 類器官的優(yōu)勢(shì)

源于多能干細(xì)胞（PSCs）的新型 3D 模型 —— 類器官，在神經(jīng)發(fā)育建模、疾病機(jī)制分析和潛在治療方法開發(fā)方面具有巨大潛力。腦類器官、脊髓類器官等類器官可在體外重現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，探究中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域間的相互作用，以及人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)化及其獨(dú)特調(diào)控機(jī)制。

因此，基于類器官的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)可用于研究涉及多個(gè)系統(tǒng)或組織的疾病過(guò)程，如神經(jīng)肌肉疾病（NMDs）、肌側(cè)索硬化癥（ALS）以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域與局部回路間的復(fù)雜連接（具體案例見表 3）。

• 主要類型及應(yīng)用

• 神經(jīng)肌肉共培養(yǎng)系統(tǒng)

神經(jīng)肌肉疾?。∟MDs）由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌或神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）的功能缺陷引起，而 NMJ 是一種獨(dú)特的特殊化學(xué)突觸，在將脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的信息傳遞和放大到骨骼肌過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Martins 等人利用人多能干細(xì)胞（hPSC）來(lái)源的軸干細(xì)胞生成了可在三維空間中維持?jǐn)?shù)月的人神經(jīng)肌肉類器官（NMOs）。這些 NMOs 具有自組織特性，可同時(shí)生成脊髓神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞，并產(chǎn)生由功能性 NMJ 驅(qū)動(dòng)的收縮活動(dòng)，為深入了解人類發(fā)育過(guò)程以及分析不同細(xì)胞類型在 NMDs 中的作用提供了獨(dú)特視角。

該研究的優(yōu)勢(shì)在于這些 NMOs 直接源于多能干細(xì)胞，可分別分化為屬于外胚層或中胚層的脊髓神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞。未來(lái)的挑戰(zhàn)在于實(shí)現(xiàn) NMOs 的成熟，并探究發(fā)育過(guò)程中功能性 NMJ 如何形成。例如，ALS 是一種進(jìn)行性 NMD，涉及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失和肌肉。為提供研究 ALS 發(fā)病機(jī)制的平臺(tái)，Osaki 等人在 3D 基質(zhì)中共同培養(yǎng)骨骼肌束和 iPSCs，在該 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)中，可觀察到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與骨骼肌形成功能性連接的 NMJ，且二者具有協(xié)同作用。

目前，體外 NMJ 模型主要用于小規(guī)模獨(dú)立研究，未來(lái)有望通過(guò)共培養(yǎng)系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展，加深對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病的分子水平理解，并助力藥物篩選，為人類 NMD 病理生理學(xué)研究和開發(fā)實(shí)用有效的治療策略提供可能。

組裝體（Assembloids）：多器官共培養(yǎng)系統(tǒng)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，許多神經(jīng)細(xì)胞聚集形成有機(jī)網(wǎng)絡(luò)或回路，不同腦區(qū)與局部回路間存在復(fù)雜連接，相互影響并決定中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動(dòng)，而協(xié)調(diào)與整合是完成這些功能活動(dòng)的重要特征，但人類在這些關(guān)鍵活動(dòng)的功能研究方面仍存在較大局限。在體外融合具有不同區(qū)域特性的多個(gè)類器官，為研究特定神經(jīng)元細(xì)胞類型的相互作用以及有機(jī)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)調(diào)提供了機(jī)會(huì)。值得注意的是，這些體外特定類器官可在個(gè)性化人類微生理系統(tǒng)中由 hPSCs 生成。

2017 年，Birney 等人構(gòu)建了一種人類 3D 微生理系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含功能整合的谷氨酸能神經(jīng)元和 γ- 氨基丁酸能（GABA）神經(jīng)元，分別類似背側(cè)或腹側(cè)前腦，能夠捕捉更復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程。此外，通過(guò)融合區(qū)域特異性類器官并進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，可分析人類中間神經(jīng)元的遷移和整合，用于模擬人類中間神經(jīng)元遷移。值得一提的是，融合類器官中的神經(jīng)元比非融合單一類器官中的神經(jīng)元表現(xiàn)出更高的放電頻率，這表明融合類器官具有單一類器官所不具備的額外神經(jīng)元特性。例如，人類內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起類器官和皮質(zhì)類器官可生成具有生理功能的神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

最典型的基于類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)是腦 - 脊髓 - 骨骼肌組裝體，可用于模擬 NMDs。2019 年，Lancaster 團(tuán)隊(duì)發(fā)表了一種在氣 - 液界面培養(yǎng)腦類器官的方案，并成功利用腦類器官控制肌肉收縮。該系統(tǒng)不僅大幅提高了神經(jīng)元的成熟度和存活率，還能使腦類器官神經(jīng)元的軸突侵入脊髓，進(jìn)而通過(guò)控制脊髓來(lái)控制肌肉，在體外重現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域與局部回路間的復(fù)雜連接。

表 3 基于類器官的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)案例

四、基于微流控平臺(tái)的神經(jīng) - 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)

1. 微流控平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)與組成

闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同腦區(qū)與局部回路間的復(fù)雜連接需要長(zhǎng)期培養(yǎng)和精確控制。為實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)，研究人員構(gòu)建了微流控裝置來(lái)模擬體外環(huán)境，在該裝置中，不同類型的細(xì)胞在相互連接的獨(dú)立腔室中培養(yǎng)。微流控裝置可通過(guò)流體循環(huán)為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，使細(xì)胞暴露于分化、生長(zhǎng)、存活和增殖所需的空間信號(hào)或信號(hào)梯度，還能在可重復(fù)的體外培養(yǎng)條件下分析動(dòng)態(tài)的細(xì)胞間相互作用。近年來(lái)，微流控系統(tǒng)已在癌癥研究、藥物篩選、血管模型和神經(jīng)科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

微流控系統(tǒng)是一個(gè)整合了微流體驅(qū)動(dòng)、操控、監(jiān)測(cè)、反應(yīng)、檢測(cè)和分析等功能的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，通常由流體驅(qū)動(dòng)子系統(tǒng)、過(guò)程監(jiān)測(cè)子系統(tǒng)、微流控芯片以及檢測(cè)分析子系統(tǒng)等不同子系統(tǒng)組成。其中，微流控芯片是系統(tǒng)的核心組件，通常需根據(jù)研究應(yīng)用設(shè)計(jì)微流控芯片，再根據(jù)芯片功能需求選擇所需的其他組件。微流控芯片的主要特征是其有效結(jié)構(gòu)（通道、反應(yīng)室和某些其他功能組件）在至少一個(gè)維度上以微米尺度容納流體。由于微米尺度的結(jié)構(gòu)，流體在其中表現(xiàn)出與宏觀尺度不同的特定性質(zhì)，因此具有獨(dú)特的分析特性。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，微流控裝置具有諸多優(yōu)勢(shì)，如可實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞類型的空間分離，能更好地控制細(xì)胞微環(huán)境，且與 3D 細(xì)胞培養(yǎng)兼容，為構(gòu)建疾病模型開辟了新途徑（具體案例見表 4）。

表 4 微流控平臺(tái)案例

2. 微流控平臺(tái)的應(yīng)用案例

• 突觸可視化與細(xì)胞分化研究

Taylor 等人利用分區(qū)微流控腔室嘗試對(duì)兩組不同的海馬神經(jīng)元進(jìn)行分區(qū)培養(yǎng)，以便觀察它們之間的突觸。該微流控分區(qū)由兩個(gè)主要腔室組成，通過(guò)多個(gè)平行微槽連接。

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元軸突會(huì)交織進(jìn)入微槽和相鄰的分區(qū)腔室，表明兩組不同神經(jīng)元群體之間的突觸可在微槽內(nèi)形成。隨后，Vitis 等人開發(fā)了一種三腔室裝置，可用于控制細(xì)胞遷移、不同腔室間的神經(jīng)突導(dǎo)向以及芯片上的細(xì)胞分化。該平臺(tái)有三個(gè)不同的可灌注腔室，具有不同的入口和出口，通過(guò)一系列狹窄且平行的微通道連接。在這項(xiàng)研究中，進(jìn)行了長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在微流控系統(tǒng)中可分化為特定表型。

• 神經(jīng)血管模型構(gòu)建

Adriani 等人開發(fā)了一種微流控裝置，該裝置包含兩個(gè)中央 3D 水凝膠區(qū)域，其中含有模擬神經(jīng)組織的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，兩側(cè)是兩個(gè)培養(yǎng)基通道，其中一個(gè)通道中培養(yǎng)模擬血管壁的腦內(nèi)皮細(xì)胞。每個(gè)通道都與相鄰?fù)ǖ老嗤?，為?xì)胞間相互作用和分子信號(hào)交換提供了可能。他們展示了由原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的這種 3D 神經(jīng)血管模型的功能。

在另一項(xiàng)研究中，Zahavi 等人開發(fā)了一種微流控系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)軸突向外生長(zhǎng)并支配遠(yuǎn)端腔室中的肌肉，該研究為深入分析運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和肌肉之間的雙向分子通訊提供了幫助。

• 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型研究

基于微流控系統(tǒng)的共培養(yǎng)系統(tǒng)也是理想的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病體外模型。Kunze 等人開發(fā)了一種微流控系統(tǒng)，在兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞腔室中分別培養(yǎng)健康神經(jīng)元和患病神經(jīng)元，該系統(tǒng)中形成了神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)連接，為體外研究阿爾茨海默?。ˋD）中受影響和未受影響神經(jīng)元之間的相互作用提供了新平臺(tái)。

此外，Park 等人開發(fā)了一種神經(jīng)元 - 星形膠質(zhì)細(xì)胞 - 小膠質(zhì)細(xì)胞的微流控培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞募集、促炎細(xì)胞因子 / 趨化因子分泌以及神經(jīng)元 / 星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失，克服了以往 AD 神經(jīng)元模型無(wú)法包含小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥變化的局限性。

微流控系統(tǒng)不僅可用于細(xì)胞培養(yǎng)，還可應(yīng)用于組織切片培養(yǎng)。有研究利用微流控系統(tǒng)在通過(guò)微通道相互連接的腔室中培養(yǎng)海馬切片，切片通過(guò)微通道延伸軸突，形成功能性連接，為研究癲癇的病理生理機(jī)制和藥物篩選提供了新思路。此外，該平臺(tái)還可用于研究其他腦區(qū)之間的通路（包括前額葉皮質(zhì)、海馬、杏仁核和下丘腦之間的邊緣系統(tǒng)通路），有助于更深入地了解大腦的信息處理回路。

五、利用共培養(yǎng)系統(tǒng)建立微生物感染神經(jīng)疾病模型

某些微生物（如病毒）可穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此可將類器官與微生物共培養(yǎng)，建立微生物感染神經(jīng)疾病模型。本文主要總結(jié)了共培養(yǎng)系統(tǒng)中病毒感染腦類器官的相關(guān)研究。

1. 利用腦類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)研究寨卡病毒（ZIKV）損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)

ZIKV 是一種蚊媒黃病毒，成人感染通常癥狀較輕，但母嬰垂直傳播可導(dǎo)致新生兒小頭癥。許多研究通過(guò) 2D 神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）單細(xì)胞培養(yǎng)、3D 神經(jīng)球培養(yǎng)或前腦切片培養(yǎng)來(lái)模擬 ZIKV 感染，但這些模型都難以揭示 ZIKV 誘導(dǎo)小頭癥的機(jī)制。而在一定程度上可模擬體內(nèi)神經(jīng)發(fā)育的腦類器官則是研究該機(jī)制的理想模型。

Haddow 等人利用 ZIKV 感染的前腦類器官進(jìn)行研究，觀察到感染的前腦類器官體積較對(duì)照組顯著減小。該研究表明，ZIKV 進(jìn)入胎兒大腦后，會(huì)靶向作用于 NPCs 的增殖，導(dǎo)致皮質(zhì)發(fā)育出現(xiàn)類似小頭的缺陷。

此外，Garcez 等人從多個(gè)層面（包括 iPSC 來(lái)源的 NSCs、NSC 形成的神經(jīng)球和人 iPSC 來(lái)源的腦類器官）研究了 ZIKV 感染對(duì)神經(jīng)分化和神經(jīng)發(fā)生的影響，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí) ZIKV 通過(guò)靶向 NPC 群體抑制神經(jīng)發(fā)育，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而影響神經(jīng)球形成。這些研究為揭示 ZIKV 對(duì)人類大腦發(fā)育的影響做出了貢獻(xiàn)，也進(jìn)一步證實(shí)了 ZIKV 感染 NPCs 與新生兒小頭癥之間的關(guān)聯(lián)。除揭示機(jī)制外，ZIKV 感染的腦類器官還可用于篩選治療 ZIKV 感染的藥物。

2. 病毒 - 腦類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)為探究 SARS-CoV-2 潛在神經(jīng)毒性提供初步見解

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）引起的 2019 冠狀病毒?。〞?huì)導(dǎo)致潛在致命的呼吸道癥狀，同時(shí)也會(huì)對(duì)腎臟、心臟、肝臟和大腦等其他器官造成損傷和功能障礙。越來(lái)越多的臨床證據(jù)表明，患者會(huì)出現(xiàn)腦血管損傷、精神狀態(tài)改變、腦病、低張力、嗅覺減退和神經(jīng)精神障礙等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，部分患者的尸檢結(jié)果也顯示其大腦中存在該病毒。

鑒于腦類器官的特性，其被廣泛用于研究病毒對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染部位及其潛在作用靶點(diǎn)。研究表明，SARS-CoV-2 可感染腦脈絡(luò)叢，并破壞腦類器官中的血腦屏障。另一項(xiàng)研究利用人 iPSC 來(lái)源的腦細(xì)胞單層和區(qū)域特異性腦類器官進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn) SARS-CoV-2 感染與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞功能缺陷相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，腦類器官為揭示  神經(jīng)精神并發(fā)癥的病理生理線索和潛在治療方案提供了有前景的工具。

值得注意的是，從 2D 單層細(xì)胞模型到 3D 神經(jīng)球和腦類器官模型，在不同水平進(jìn)行全面研究，將有助于更深入、更全面地分析 SARS-CoV-2 感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制。通常，神經(jīng)球模型代表神經(jīng)發(fā)生的早期特征，而腦類器官模型則展現(xiàn)出人類皮質(zhì)發(fā)育的特征，能重現(xiàn)人類大腦的發(fā)育過(guò)程和生理結(jié)構(gòu)。

綜上，共培養(yǎng)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于缺血性中風(fēng)、帕金森?。≒D）、阿爾茨海默病（AD）和肌側(cè)索硬化癥（ALS）等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，這有望成為未來(lái)神經(jīng)科學(xué)研究的趨勢(shì)。隨著共培養(yǎng)和類器官建模技術(shù)的發(fā)展，基于腦類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)將在神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制研究和臨床前研究中發(fā)揮更大作用。

六、結(jié)論與未來(lái)展望

1. 共培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展與優(yōu)勢(shì)

共培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)目的是模擬體內(nèi)發(fā)生的細(xì)胞相互作用，通過(guò)共培養(yǎng)系統(tǒng)研究神經(jīng)細(xì)胞間相互作用和神經(jīng)回路，需要滿足所有相關(guān)細(xì)胞類型需求的復(fù)雜培養(yǎng)條件。目前，細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)已從 2D 發(fā)展到 3D 組裝體，微流控裝置的進(jìn)步使細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境更接近體內(nèi)生理環(huán)境。

毫無(wú)疑問(wèn)，新型 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型是克服傳統(tǒng)單層培養(yǎng)局限性的有效方法，尤其是 3D 組裝體在模擬各種疾病狀態(tài)、藥物篩選以及研究生理和病理?xiàng)l件下細(xì)胞間相互作用方面具有巨大潛力。最重要的是，科研人員可利用患者來(lái)源的細(xì)胞生成這些組裝體，構(gòu)建個(gè)性化疾病模型，開展個(gè)體化治療研究。

2. 共培養(yǎng)系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)

然而，3D 組裝體仍缺乏血管或免疫細(xì)胞等關(guān)鍵組成部分，因此將多個(gè)類器官組合成一個(gè)大型單一結(jié)構(gòu)時(shí)，難以避免中心壞死的問(wèn)題。另一個(gè)重大挑戰(zhàn)是共培養(yǎng)模型的標(biāo)準(zhǔn)化。

3. 未來(lái)發(fā)展方向

結(jié)合當(dāng)前培養(yǎng)、生物傳感器和微流控等多學(xué)科技術(shù)，有望開發(fā)出更復(fù)雜、可重復(fù)且更接近自然的體外組織模型。毫無(wú)疑問(wèn)，多器官共培養(yǎng)系統(tǒng)在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用和理論研究中已取得一定成果，為該領(lǐng)域研究開辟了新的可能性和方向。

以上內(nèi)容發(fā)表于《International Journal of Molecular Sciences》2022 年第 23 卷，由吉林大學(xué)相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)

Rongrong Liu et al.撰寫，系統(tǒng)綜述了用于研究神經(jīng)細(xì)胞相互作用的共培養(yǎng)模型，涵蓋 2D、3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)及微流控平臺(tái)的應(yīng)用，還探討了其在病毒感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病模型中的作用，并對(duì)未來(lái)研究方向進(jìn)行展望。

共培養(yǎng)系統(tǒng)（尤其是基于類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)）是控制和分析細(xì)胞相互作用的*工具和技術(shù)集合。但類器官模型是人類組織實(shí)驗(yàn)研究中的技術(shù)，與傳統(tǒng)模型相比仍處于探索階段，其穩(wěn)定性、可重復(fù)性、可擴(kuò)展性以及如何精確控制微環(huán)境條件，已成為基于類器官的共培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展需要克服的問(wèn)題。為構(gòu)建用于細(xì)胞相互作用研究的相關(guān)共培養(yǎng)系統(tǒng)，將類器官模型與標(biāo)準(zhǔn)化微裝置相結(jié)合是未來(lái)的重要發(fā)展方向。

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Kirkstall Quasi Vivo 系統(tǒng)應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)研究，借鑒微流控平臺(tái)優(yōu)勢(shì)，以動(dòng)態(tài)灌流模擬體內(nèi)微環(huán)境，為神經(jīng)細(xì)胞提供更接近生理的培養(yǎng)條件，助力深入探究神經(jīng)細(xì)胞間的復(fù)雜相互作用，如神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)傳遞、神經(jīng)回路形成等機(jī)制，彌補(bǔ)傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)不足，為神經(jīng)科學(xué)研究提供新工具。

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