由密歇根州立大學Aitor Aguirre團隊主導構建了一個人類心臟-巨噬細胞組合體（hHMA）模型，shou ci在體外重現了胚胎期心臟駐留巨噬細胞（TRMPs）的發育整合、功能調控及其在炎癥驅動的心律失常（如房顫）中的作用。

一、研究背景：為什么做？

• 心臟巨噬細胞（TRMPs）在胚胎期即定植心臟，參與心臟發育、電傳導、細胞外基質（ECM）重塑、凋亡細胞清除（efferocytosis）等關鍵過程。

• 現有心臟類器官（hHO）缺乏TRMPs，無法模擬免疫-心臟互作。

• 房顫（AF）等心律失常與慢性炎癥密切相關，NLRP3炎癥小體激活是核心機制之一，但缺乏人源化模型進行機制研究和藥物篩選。

二、技術路線：怎么做？

1. 構建hHMA：心臟類器官+巨噬細胞：“先讓心臟類器官（hHO）長到容易‘接待’巨噬細胞的時間窗，再把 hPSC 來源的卵黃囊樣單核細胞按胚胎定植節奏分三批‘投遞’進去，讓它們在類器官內自然分化成組織駐留巨噬細胞（TRMPs）。"

心臟類器官（hHO）：由hPSC通過自組裝分化形成，包含心室/心房肌細胞（VCM/ACM）、成纖維細胞（CF）、內皮細胞（ENC）、瓣膜細胞（VC）等。

巨噬細胞來源：hPSC分化為卵黃囊樣原始單核細胞（CD14+），在hHO發育第8、12、16天分批次整合，模擬胚胎期TRMPs定植。

整合效率：20,000–30,000單核細胞/次，最終TRMPs占比1–3%，與胚胎心臟一致。

巨噬細胞來源與預培養

• 細胞來源

• 與心臟類器官同基因背景的 hPSC（H9、H1、iPSC-L1 等均可）。

• 單核細胞分化（Yanagimachi 5 步法改良）

• D0：hPSC 用 Accutase 解離 → 80 ng/mL BMP4 + 2 µM Thiazovivin 誘導 EB。

• D2：EB 貼 Matrigel，續用 BMP4。

• D4：換液，加 VEGF/SCF/bFGF（造血血管過渡）。

• D6–D14：依次加 SCF、IL-3、TPO、M-CSF、FLT-3L，向髓系傾斜。

• D18 起：每 4 d 收一次非貼壁細胞 → 富集 CD14?單核細胞（MACS，130-050-201 Miltenyi）→ 純度 ≥ 94%。

• 收得細胞立即使用或 4 °C 保存 ≤ 6 h，以保證存活與整合效率。

心臟類器官準備（hHO）

• 標準流程（Lewis-Israeli 2021 改良）

• D0：10 000 hPSC/孔，96 孔超低吸附圓底板，100 g 離心 3 min 促聚集。

• D1：加 CHIR99021（4 µM）+ BMP4 + Activin A，24 h。

• D2：換 RPMI/B27(-insulin)。

• D4：加 Wnt-C59（2 µM），48 h。

• D6–D8：基礎 RPMI/B27(-insulin)。

• D7：短暫再 CHIR（2 µM，1 h）→ 誘導心外膜前體。

• D8 起：換 RPMI/B27(+insulin) 每 48 h 換液。

• 關鍵質量檢查

• D8 細胞數 ≈ 2.9 × 10?/類器官（PicoGreen 定量）。

• 轉錄水平：VCAM1 高、TNNT2 陽性，無 CD45/PTPRC 信號（確保無內源免疫細胞）。

2. 模型成熟與疾病誘導

成熟期：第20–30天使用增強成熟培養基（EMM2/1），含脂肪酸、甲狀腺激素、IGF-1等。

炎癥刺激：第30–64天加入LPS+IL-1β+IFN-γ（低/中/高劑量），模擬慢性炎癥狀態。

藥物干預：使用NLRP3抑制劑MCC950驗證機制。

三、主要發現：得到了什么？

1. TRMPs成功整合并長期存活

形態：TRMPs均勻分布于心臟類器官內部，形成CX43間隙連接與心肌細胞電耦合。

轉錄組：表達TRMP標志物（CD14、CD68、CD163、CSF1R、MRC1），不表達CCR2（符合胚胎TRMP特征）。

功能：

• efferocytosis：吞噬凋亡心肌細胞，依賴MERTK通路。

• ECM重塑：調控膠原纖維（COL1A1）分布，促進心室肌細胞成熟與收縮力增強。

• 電生理：TRMPs表現出更長動作電位時程（APD），與心肌細胞同步鈣瞬變。

2. TRMPs重塑心臟細胞組成

scRNA-seq顯示：TRMPs促進心室肌細胞（VCM）、成纖維細胞（CF）、瓣膜細胞（VC）增殖，減少傳導細胞（CC）、內皮細胞（ENC）等。

配體-受體分析：TRMPs通過SPP1-整合素軸與所有心臟細胞類型通訊，分泌SPP1+胞外囊泡（EVs），富含炎癥、遷移、代謝相關蛋白。

四、機制解析：TRMPs如何參與心律失常？

1. 炎癥激活TRMPs

NLRP3炎癥小體激活：中高劑量炎癥刺激下，TRMPs表達NLRP3、CASP1、IL-1β、IL-6、TNF-α，分泌促炎因子，形成ASC specks。

表型轉化：從穩態（M0）向M1型極化，同時嘗試通過IL-10進行負調控。

2. 心房肌細胞（ACM）電生理異常

心律失常表型：

• 自發性不規則節律（ectopic beats）

• 早期后除極（EADs）

• 延遲后除極（DADs）

• 自發鈣升高（SCaEs）

機制：

• NLRP3激活導致鈣處理異常（RYR2上調）

• ECM重塑（COL1A1、COL3A1、FN1上調）

• 細胞黏附分子VCAM1上調

藥物驗證：MCC950抑制NLRP3，顯著減少EADs和ASC specks，部分恢復電生理穩定性。

五、疾病模型：房顫（AF）的體外重現

六、創新點

1. 在體外構建人源化心臟-巨噬細胞組合體，重現胚胎期TRMPs整合。

2. 將NLRP3炎癥小體激活與人源心房心律失常直接關聯。

3. 實現TRMPs-心肌細胞電耦合的活體成像與功能驗證。

4. 在體外模型中重現房顫的免疫-電生理特征，并驗證藥物靶點。

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