一、實驗目的

利用北京基爾比生物科技有限公司研制的 Kilby Gravity 微重力旋轉細胞培養系統（雙軸旋轉重力矢量分散機制，模擬 10?3G 微重力環境），建立 WB-F344 肝干細胞三維培養模型。

通過對比傳統二維平面培養，評估微重力旋轉培養環境對肝干細胞增殖特性及干性維持的影響，重點檢測肝干細胞特異性標志物甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）的表達變化，為肝干細胞大規模擴增及肝組織工程提供標準化實驗方案。

二、實驗材料

2.1 細胞與試劑

• 細胞株：大鼠 WB-F344 肝干細胞

• 微載體：Cytodex 3（Sigma 公司，1 mg/ml 工作濃度）

• 基礎培養基：DMEM（含 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素）

• 檢測試劑：

  RNA 提取試劑盒（Fermentas）

  RT-PCR 試劑盒（含 M-MLV 逆轉錄酶）

  引物：AFP、ALB、β-actin

  一抗：羊抗大鼠 AFP 單抗、山羊抗大鼠 ALB 單抗（DAKO）

  二抗：FITC 標記兔抗羊 IgG（DAKO）

  PI/RNase 染液（細胞周期檢測）

2.2 關鍵設備

Kilby Gravity 微重力旋轉式細胞培養系統（北京基爾比生物科技有限公司），二氧化碳培養箱（37°C，5% CO?），流式細胞儀（細胞周期分析），熒光顯微鏡（免疫熒光觀察），紫外分光光度計、PCR 儀、凝膠成像系統

三、實驗方法

3.1 細胞準備與微載體接種

1. 細胞復蘇與預培養：WB-F344 細胞于 T25 培養瓶中常規平面培養（37°C，5% CO?），DMEM wan quan培養基，每 2 天換液，至 80% 匯合度。

2. 微載體預處理：Cytodex 3 微載體經 PBS 浸泡 4 h，高壓蒸汽滅菌（121°C，15 min），培養基洗滌 3 次后備用。

3. 細胞-微載體復合：

• 消化收集 WB-F344 細胞，計數調整至 1×10? cells/ml

• 按細胞:微載體 = 1×10? cells : 1 mg 比例混合于 50 ml 離心管

• 37°C 靜置 3-4 h（每 30 min 輕柔搖晃一次），使細胞貼附微載體

3.2 Kilby Gravity 系統與微重力旋轉式培養（實驗組）

1. 裝載樣品：

• 將細胞-微載體懸液轉移至 T25 透氣型培養瓶（Kilby Gravity 旋轉系統搭載），總體積 15-20 ml

• 將培養瓶固定于 Kilby Gravity 主機搭載架，確保旋轉軸平衡

2. 參數設置（觸屏操作）

3. 培養環境：

   將 Kilby Gravity 主機置于 CO? 培養箱內（37°C，5% CO?，飽和濕度）

   換液策略：第 3 天半量換液（微重力環境下代謝廢物分布較均勻，采用低速離心 800 rpm 收集細胞-微載體復合物，更換 50% 新鮮培養基后回裝）

3.3 平面培養對照組

常規二維培養：細胞接種于普通 T25 培養瓶（5×10? cells/瓶），相同培養基，37°C，5% CO? 靜態培養，每 2 天換液，培養 7 天。

四、檢測指標與方法

4.1 細胞形態學觀察（第 3、7 天）

取樣：輕輕取出 Kilby Gravity 培養瓶，靜置 2 min 使微載體沉降，吸出部分懸液于 24 孔板

顯微鏡觀察：倒置相差顯微鏡觀察微載體表面細胞貼附、鋪展及三維聚集體形成（200×）

對比平面培養組細胞形態（多角形貼壁 vs 微載體表面三維構象）

4.2 細胞周期分析（流式細胞術，第 7 天）

1. 細胞收集：

   微重力旋轉培養組：收集培養瓶內懸液，0.25% 胰酶消化（37°C，5 min）使細胞脫離微載體，300 目篩網過濾去除微載體，離心（1500 rpm，5 min）

   平面組：常規胰酶消化收集

2. PI 染色：細胞懸液（5×10? cells/ml）加入 PI 染液（50 μg/ml PI，含 RNase），室溫避光 15 min

3. 流式檢測：上機檢測 G0/G1、S、G2 期細胞比例，ModFit 軟件分析

   預期結果：微重力組 S 期和 G2 期比例增加，提示增殖活性增強

4.3 RT-PCR 檢測 AFP 與 ALB mRNA 表達（第 7 天）

1. RNA 提取：TRIzol 法提取兩組細胞總 RNA，紫外分光光度計檢測純度（A260/A280 = 1.8-2.0）

2. 逆轉錄：M-MLV 逆轉錄酶，2 μg RNA 合成 cDNA（反應條件：42°C 60 min，70°C 10 min）

3. PCR 擴增：

   

   反應條件：94°C 預變性 1 min；94°C 30 s，退火 1 min，72°C 1 min，35 個循環；72°C 終末延伸 10 min

4. 電泳分析：1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照，ImageJ 軟件分析條帶灰度值（目的基因/β-actin 比值）

4.4 免疫熒光染色檢測蛋白表達（第 7 天）

1. 細胞固定：收集細胞接種于 24 孔板（預先放置滅菌蓋玻片），貼壁 24 h 后，4% 多聚甲醛固定 15 min，0.1% Triton X-100 透化

2. 封閉：5% 正常山羊血清室溫封閉 30 min

3. 一抗孵育：加入稀釋一抗（抗 AFP 或抗 ALB，1:100），37°C 濕盒 1 h，PBS 洗 3 次

4. 二抗孵育：FITC 標記兔抗羊 IgG（1:200），37°C 濕盒 30 min，PBS 洗 3 次

5. 核染色：PI（紅色）或 Hoechst 33258（藍色）染核，室溫 5 min

6. 鏡檢：熒光顯微鏡觀察，隨機選取 6 個視野計數陽性細胞率（綠色熒光為陽性信號）

五、預期實驗結果

5.1 細胞形態與增殖

• Kilby Gravity 旋轉式培養組：細胞在 Cytodex 3 微載體表面貼附良好，第 3 天形成單層鋪路石樣生長，第 7 天形成致密三維多細胞聚集體（球狀體），細胞間連接緊密，折光性強

• 流式結果：微重力組 S 期細胞比例（約 53%）顯著高于平面組（約 46%），G0/G1 期比例降低， Kilby Gravity 旋轉式培養系統促進肝干細胞增殖

5.2 干性標志物表達特征

• RT-PCR：微重力旋轉式細胞組 AFP mRNA 表達量顯著高于平面組（上調約 1.5-2 倍），ALB mRNA 表達量低于平面組

• 免疫熒光：AFP 陽性率微重力旋轉式細胞組較平面組增加約 20%，ALB 陽性率降低約 28%

• 解讀：AFP 高表達/ALB 低表達提示肝干細胞未分化狀態維持良好，Kilby Gravity 系統的低剪切力、三維動態環境有助于保持干細胞特性，抑制過早分化

六、技術優勢與討論要點

6.1 技術參數優化依據

• 轉速選擇（2 rpm）： Kilby Gravity 采用 雙軸隨機旋轉，1-4 rpm 即可實現 10?3G 微重力模擬，轉速更低，剪切力更小（<0.5 dyn/cm2），更適合肝干細胞這種對機械應力敏感的細胞類型

• 實時重力數據：利用系統 ±0.001G 精度的三維重力監測，可客觀記錄培養期間實際重力水平，增強實驗可重復性，這是傳統 RCCS 不具備的量化優勢

客戶安裝培訓——北京基爾比Kilby Gravity 旋轉式細胞培養系統

6.2 三維培養微環境優勢

北京基爾比Kilby Gravity 旋轉式細胞培養系統通過以下機制優化肝干細胞培養：

1. 重力矢量分散：雙軸旋轉使細胞各方向重力抵消，促進細胞間自發聚集，形成類體內肝板樣三維結構

2. 優化物質交換：低速旋轉產生溫和液體流動，改善微載體內部營養滲透和代謝廢物排出，避免傳統靜態 3D 培養核心的壞死區

3. 維持細胞極性：模擬微重力環境抑制細胞骨架過度重排，維持干細胞未分化狀態的細胞形態

附：

北 京 基 爾 比 生物科技公司主營產品：

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