共聚焦顯微拉曼光譜

拉曼散射屬于一種非彈性散射，是用來研究晶格及分子的振動模式、旋轉模式和在一系統里的其他低頻模式的一種光譜技術。其原理如下圖1所示：

圖1 分子躍遷能級圖。不同的能級躍遷對應著不同的拉曼信號。線的粗細大致上表示了信號的強弱。

假設散射物分子原來處于基態，振動能級如圖1所示。當入射光照射分子時，激發光與分子的作用使分子的極化率發生變化，相當于分子對光子產生了虛的吸收，從而使電子躍遷到一個虛能級（Virtual energy state），虛能級上的電子即刻躍遷到下能級并放出光子，即散射光。其中，絕大部分散射光與入射光頻率相同，即在分子與光的相互作用過程中，沒有發生能量的轉移，這便是彈性散射，稱之為瑞利散射；而有極小一部分散射光，與分子或晶格間發生了能量轉移從而導致散射光頻率改變，這部分散射便被稱為拉曼散射。在拉曼光譜中，又把頻率小于入射光頻率的譜線稱為斯托克斯線，而把頻率大于入射光頻率的譜線稱為反斯托克斯線。 

由于不同分子或原子團的振動方式是一種，因而其拉曼散射光的頻率也是特異的，因此，拉曼光譜也別稱為“分子指紋"光譜。拉曼光譜的應用非常廣泛，其可以表征材料的化學成分、化學結構、相與形態、結晶度以及分子相互作用的信息，另外，還能夠獲得晶體內的雜質、應力、以及溫度等信息。

隨著上述各個應用領域中被檢測物的尺寸不斷縮小，特別是進入微米甚至納米尺度，對拉曼光譜的分析便要求提高其空間分辨率，因此，共聚焦顯微拉曼光譜檢測技術應運而生，其通過結合顯微鏡的顯微放大功能，以及共焦孔的限域功能，可將拉曼檢測的空間分辨率提高至光學衍射極限，即微米甚至亞微米量級。圖2是共聚焦顯微拉曼的典型光路示意圖

圖2 共聚焦顯微拉曼光譜原理圖

共焦顯微拉曼光譜能夠實現三維分辨能力，除了能夠分析微納米尺度的樣品，還可以分析多層薄膜中不同的層和界面，透明樣品表面下的雜質或污染物等。

通過點掃描或面掃描mapping功能，能夠實現拉曼光譜的二維或者三維成像。通過提取mapping中每個點的拉曼信息，拉曼成像可以顯示出各種材料屬性(成分、結構、相、多形態、應力、結晶度)的空間分布。

共聚焦顯微拉曼光譜應用

1.化學領域：

化學鍵以及對稱分子的振動頻率都是特異的，因此拉曼光譜提供了作為分子鑒別的重要手段。例如，SiO, Si2O2, 和Si3O3的振動頻率是可被鑒別出來的，并列為紅外光譜學以及拉曼光譜學配位分析的基礎。拉曼位移的大小、強度及拉曼峰形狀是鑒定化學鍵、官能團的重要依據。利用偏振特性，拉曼光譜還可以作為分子異構體判斷的依據。在催化化學中，拉曼光譜能夠提供催化劑及表面上物質的結構信息，還可以對催化劑制備過程進行實時分析。拉曼光譜是研究電極/溶液界面的結構和性能的重要方法，能夠在分子水平上深入研究電化學界面結構、吸附和反應等基礎問題并應用于電催化、腐蝕和電鍍等領域。

（參考文獻：Kraytsberg et.al., Journal of Power Sources 282.(2015):294-298）

圖3 Li離子電池Si電極在充放電過程中的原位拉曼光譜

在評估Na?S前驅體雜質對W摻雜Na?PS?合成的影響中，通過拉曼光譜可以分析得到Na?S-d 在 481、498 cm?1 處出現多硫化物（Na?S?）特征峰，Na?S-c 在 967、1005、1025 cm?1 處出現 SO?相關峰，Na?S-p 在 2560 cm?1 處有弱峰，指示微量 NaSH（純化過程中多硫化物還原產物），三者均在 207 cm?1 處有 Na?S 強振動峰。因此結合其他技術可共同推斷：Na?S-c 主要含 SO?雜質，Na?S-d 含多硫化物及微量 SO?，Na?S-p 基本無這兩類雜質，為后續研究不同雜質對電解質合成的影響提供純凈度可控的前驅體。（參考文獻：Felix Schnaubelt et.al., Energy Mater. 2025, e03047）

圖4 拉曼光譜分析商用 Na?S-c、干燥處理的 Na?S-d、純化處理的 Na?S-p的結構與雜質分布

2.食品安全

拉曼光譜法被用于檢測牛酥油中不同濃度的非乳脂肪摻雜物，包括植物油、礦物油和豬體脂肪。在 774 cm?1（鏈烷烴 C–C/C–H 伸縮）、971 cm?1（CCH 面內搖擺）、1265 和 1656 cm?1（順式-RHC=CHR 振動）處的特征拉曼峰能夠清晰地區分這些摻雜物。（參考文獻：Dinis et.al., Food Control,2025,178,111481）

圖5 .牛油(CG)、礦物油(MO)、棕櫚油(PO)、花生油(Gn0)、棉籽油(CSO)和豬體脂肪(PBF)的平均歸一化拉曼光譜

通過拉曼光譜技術實現了溫室菠菜硝酸鹽的高精度、非破壞性定量監測，結合化學計量學模型，從復雜的光譜中提取出與硝酸鹽濃度高度相關的特征，實現了對硝酸鹽的快速、精確量化為精準農業提供了可落地的解決方案。（參考文獻：Paolo et.al., Journal of Agriculture and Food Research,2025,21,101839.）

圖6 菠菜葉的堆疊拉曼光譜

在特定范圍內的光譜標記，源自于花青素和碳水化合物的振動模式，可以精確區分藍莓與草莓、樹莓、黑莓之間的細粒度區別，拉曼光譜提供了對這些漿果分子組成的更深入了解，而且為未來食品安全和質量控制的研究奠定了堅實的基礎，為食品行業的質量評估提供了一種快速、無損和廉價的方法。（參考文獻：Stephen et.al., Journal of Food Composition and Analysis,2025,137:106898）

圖7 四種漿果樣本提取物拉曼光譜

3.固態物理：

原料特性、量測溫度和找尋樣品的晶體取向。例如，對于單晶、多晶以及非晶的區分，拉曼光譜的展寬能夠表征晶體質量，通過對特定聲子模式進行監控，能夠針對二維材料很快確定其層數和厚度。另外，拉曼光譜可以監測固體的低頻激發，例如等離子體、磁振子和超導氣體的激發。通過斯托克斯線和反斯托克斯線強度的比值，能夠得知晶格的溫度。（參考文獻：Biplab et.al., App. Phys. Express, 7, 022401 (2014)）

圖8 氮化硼納米管（BNNT）的拉曼光譜，其中晶格溫度通過計算E2g模式的斯托克斯和反斯托克斯線的強度比值得出。

4.生命科學

單細胞拉曼光譜能提供細胞內核酸、蛋白質、脂質含量等大量信息，可在不損傷細胞的條件下實時動態監測細胞結構變化，從而應用于細胞水平的疾病診斷（如癌細胞檢測）、細胞藥物處理、單細胞生命活動檢測等領域。（參考文獻：Freudiger et.al., Science, 322, 1857 (2008)）

圖9 細胞內脂滴和細胞核內區域的受激拉曼散射光譜（左）和受激拉曼成像（右）。

除動物細胞外，共聚焦拉曼光譜也用于無標記、無損地可視化黃瓜（根、莖、葉組織中細胞壁的化學成分空間分布與結構特征，同時在分子和形態學水平上提供植物細胞壁復雜組織結構的多維信息。1598, 1621, 1658 cm?1等位置的峰為木質素，1092 cm?1 (C-C, C-O伸縮振動) 和 1337 cm?1 (HCC, HCO變形振動)的峰，表明纖維素是細胞壁的主要成分，1523, 1156, 1005 cm?1的強峰為類胡蘿卜素特征峰。（參考文獻：Beum et.al., Plants 2018, 7, 7）

圖10 (A) 根、莖、葉木質部細胞壁不同亞區城采集的拉曼光譜

木質素、纖維素、類胡羅卜素在不同部位的拉曼成像(B)根(C)莖(D)葉

5.半導體

拉曼光譜可用于分析半導體材料的純度，雜質、缺陷或污染物的分析，化合物半導體中合金成分、超晶格或異質結構的研究，應力或應變特性，離子注入后半導體的損傷分布，外延層的質量、組分、載流子濃度等。

圖11 單個ZnO納米環的顯微圖像（左），常規拉曼成像結果（中）和偏振拉曼成像結果（右）。

5.材料分析

拉曼光譜在材料科學中是物質結構研究的有力工具，可對各種薄膜進行結構分析，例如，單晶、多晶、微晶和非晶硅以及硼化非晶硅、氫化非晶硅、金剛石、類金剛石等碳材料等；可對耐高溫材料的相結構進行分析，研究各種納米材料的量子尺寸效應，分析高分子聚合物的分子結構和組成，立體規整性，結晶與分子鏈的取向，分子相互作用等。（參考文獻：Wang et.al., Opt. Mater. Express, 10, 1092 (2020)）

圖12 ReS2分子膜的拉曼光譜與mapping。

更多拉曼光譜技術：

1.共振拉曼光譜

通常，拉曼光譜的激發光能量與分子的吸收能級或固體中的能帶并不匹配，因此分子對激發光子的吸收是“虛"的吸收，這也是本文一開始所指的電子吸收光子躍遷到一個“虛能態"。然而，當激發光能量與待測分子的某個電子吸收峰接近或重合時，這一分子的某個或幾個特征拉曼譜帶強度可達到正常拉曼譜帶的104倍以上，并觀察到正常拉曼效應中難以出現的、其強度可與基頻相比擬的多級或組合振動光譜。常規拉曼與共振增強拉曼的原理如圖3所示。（參考文獻：Louis et al., Technol. Cancer Res. Treat. 12（4），371 (2013)）

圖13 拉曼散射電子躍遷示意圖。(a)常規拉曼散射；（b）共振拉曼散射

圖14 正常與癌變的乳腺組織的共振拉曼光譜（532nm激發）

2. 表面增強拉曼光譜（SERS）

在特殊制備的一些金屬良導體表面或溶膠中, 吸附分子的拉曼散射信號比普通拉曼散射信號大大增強，其主要分為以下兩類機理：。

（1）電磁場增強機理, 主要是由于在金屬表面發生表面等離子體共振, 這種增強效應與金屬納米粒子的大小和形狀以及聚集結構密切相關；

（2）化學增強機理，主要反映納米粒子表面化學活性位的性質，與探針分子與金屬表面的成鍵以及分子吸附取向密切相關。

表面增強拉曼克服了拉曼光譜靈敏度低的缺點，可以獲得常規拉曼光譜所不易得到的結構信息，被廣泛用于表面研究、吸附界面表面狀態研究、生物大小分子的界面取向及構型、構象研究、結構分析等，可以有效分析化合物在界面的吸附取向、吸附態的變化、界面信息等。（參考文獻：Kouba et al., Raman. Spectrosc., 49(9),1426 (2018)）

圖15 表面增強拉曼散射原理示意圖。

圖16 血液中的生物分子的表面增強拉曼光譜，其中上圖為生物分子在玻璃基底上測得的拉曼光譜，下圖為生物分子在納米Ag顆粒表面上測得的拉曼光譜。

3 近場拉曼光譜

隨著近場光學技術的成熟，將近場掃描顯微鏡系統作為外光路，與Raman光譜儀相結合，就能組成超分辨的近場Raman光譜分析系統。

近場拉曼可以同時獲得樣品的超分辨的物理和化學信息。拉曼光譜代表樣品的化學結構信息，形貌圖是樣品的物理信息。結合近場光學掃描顯微鏡的特點，可以在樣品的逐點采集拉曼光譜，在某一特定的波數形成拉曼光譜圖。可能實現在單分子水平上對物質結構的研究。（參考文獻：Steidtner et al., PRL, 100, 236101 (2008)）

圖17 近場拉曼配置示意圖。

圖18 BCB分子在有針尖增強和沒有針尖增強下的拉曼光譜。