產品名稱：Nanoject III顯微注射器（美國drummond）

                     PC-100垂直拉制儀（日本Narishige）

                     體式顯微鏡（PONCHI ）

研究方向：

• 1.蜱媒吸血行為的機制研究

• 2.共生菌影響蜱媒感染病原體的分子機制

• 3.蜱蟲繁殖及蜱傳疾病的防控應用

Drummond Nanoject III 納升級顯微注射系統，搭配體視顯微鏡和三維顯微操作器，是實驗室進行蜱蟲顯微注射的標準配置。以下是針對硬蜱成蜱 / 若蟲（常用）和胚胎的詳細注射方法及關鍵注意事項，適用于病原體感染、基因編輯（RNAi/CRISPR）、藥物篩選等實驗。

一、實驗前準備

1. 設備與耗材

• 核心設備：Nanoject III 注射儀（圖中黑色控制器 + 紅色注射筆）、體視顯微鏡（帶環形光源）、三維手動顯微操作器、CO?麻醉裝置

• 專用耗材：Drummond 原裝玻璃毛細管（3.5"×0.5mm ID）、微電極拉制儀、鑷子（精細鑷 #5）、雙面膠 / 石蠟、培養皿、濕盒

• 樣品準備：待注射溶液（病原體懸液、dsRNA、質粒等），經 0.22μm 濾膜除菌，避免堵塞針頭

2. 注射針制備

1. 使用微電極拉制儀將玻璃毛細管拉制成jian端直徑5-10μm的注射針（硬蜱體壁較厚，jian端過細易折斷）

2. 用砂輪或針鍛儀將針尖斜切 45°，形成鋒利的斜面，便于穿透體壁

3. 將注射針安裝到 Nanoject III 注射筆的黑色夾頭上，擰緊卡盤固定

二、成蜱 / 若蟲注射方法（常用）

1. 蜱蟲麻醉

• 將待注射蜱蟲放入 CO?麻醉盒中，通入 100% CO?，麻醉時間 30-60 秒（以蜱蟲停止活動但足仍有輕微抽動為宜）

• 麻醉過度會導致蜱蟲死亡，麻醉不足則注射時會劇烈掙扎

2. 蜱蟲固定

• 在培養皿底部貼一條雙面膠，將麻醉后的蜱蟲背部朝下粘在膠帶上，確保腹部暴露

• 對于未吸血的若蟲 / 幼蟲，可使用石蠟進行固定：將融化的石蠟滴在蜱蟲身體兩側，僅露出注射部位

• 固定時注意不要遮擋氣門（位于蜱蟲腹部兩側），否則會導致窒息死亡

3. 樣品裝載

1. 在 Nanoject III 主機上選擇手動填充模式，將注射針jian端浸入樣品溶液中

2. 點擊 "Fill" 按鈕，緩慢填充樣品至注射針內，避免產生氣泡

3. 填充完成后，點擊 "Empty" 按鈕排出少量液體，確認針頭通暢

4. 注射操作

1. 在體視顯微鏡下（10-20 倍放大），調節顯微操作器，將注射針jian端對準注射部位：

• 部位：gang門孔（anal pore），位于蜱蟲腹部末端，體壁最薄，注射后存活率最高

• 備選部位：第 3-4 對足之間的節間膜，或腹部側面的節間膜

2. 輕輕轉動顯微操作器旋鈕，將注射針緩慢刺入蜱蟲體腔，刺入深度0.5-1mm

3. 在 Nanoject III 主機上設置注射參數：

• 注射體積：未吸血若蟲50-200nL，未吸血成蜱200-500nL，吸血成蜱500-1000nL

• 注射速率：20-50nL/sec，速率過快會導致體腔壓力驟增，蜱蟲破裂

4. 點擊 "Inject" 按鈕完成注射，停留 2-3 秒后緩慢拔出注射針

5. 注射后護理

1. 將注射后的蜱蟲從雙面膠上輕輕取下，放入鋪有濕濾紙的培養皿中

2. 在 **25-27℃、相對濕度 > 90%** 的培養箱中恢復 24 小時

3. 恢復后可進行后續實驗（如吸血、飼養、檢測等）

三、蜱蟲胚胎注射方法（用于基因編輯）

1. 胚胎收集

• 將吸血后 7-10 天的雌性硬蜱放入產卵盒中，在 27℃、90% 濕度條件下收集新鮮胚胎（產卵后 1-2 小時內最佳）

• 用次氯酸鈉溶液（0.5%）處理胚胎 30 秒，去除表面蠟層，然后用無菌水沖洗 3 次

2. 胚胎固定

• 將處理后的胚胎排列在載玻片上的雙面膠帶上，腹部朝上

• 用鎢絲針輕輕刺破胚胎的卵殼，釋放少量卵黃，降低卵內壓力（蜱蟲卵內壓力高，不減壓會導致注射時內容物噴出）

3. 注射操作

• 注射針jian端直徑1-2μm，注射體積10-50nL / 胚胎

• 注射部位選擇胚胎的后端（遠離生殖質的區域）

• 注射后將胚胎轉移至濕盒中，在 27℃、90% 濕度條件下培養至孵化