熒光分子在生物研究中的應用是許多應用的標準，并且由于其具有多功能性、靈敏度和定量能力，其用途在不斷增加。在眾多用途中，熒光探針用于檢測蛋白位置和活化，識別蛋白復合物形成和構象改變以及監測體內的生物過程。使用免疫熒光方法來展現這張代表性圖像。

使用熒光基團偶聯抗體檢測靶蛋白。小鼠皮層神經元中的突觸素（紅色）和微管相關蛋白 2（MAP2；綠色）分別使用特異性一抗和 Thermo Scientific DyLight 650 偶聯的山羊抗家兔或 DyLight 488-Goat 抗小鼠二抗進行熒光標記。均使用 Hoechst 染料標記兩面板中的細胞核。

本頁內容

· 熒光介紹

· 熒光基團種類

· 熒光檢測和定量

· 熒光標記

· 影響熒光發射或檢測的因素

熒光介紹

熒光的機制

熒光分子也稱為熒光基團或簡單稱為熒光體，與其他分子相比，它對光具有明顯響應。如下文所示，激發光光子被熒光微球的電子吸收，從而將電子的能量水平提高到激發狀態。在這一短暫的激發期內，部分能量會通過分子碰撞消散或轉移到近端分子，剩余的能量會作為光子發射，從而讓電子恢復其基態。由于發射的光子通常攜帶更少的能量，因此波長比激發光子更長，從而將發射熒光與激發光相區分。熒光基團的激發和光子發射具有周期性，且直至熒光基團發生不可逆地受損（參見見下文的光子漂白）前，其可重復激發。因此熒光基團可以通過該激發和發射周期發射許多光子，可用于多種研究應用。

熒光的 Jablonski 能量圖。

熒光光譜

激發和發射波長都是每種熒光基團的特異性特性，雖然這些波長與單原子熒光基團處于離散狀態，但多原子熒光基團表現出廣泛的激發和發射光譜。在 X-Y 圖上繪制熒光分子（單原子和多原子）光譜，表明與每個熒光基團的最大和最小激發和發射信號強度相對應的波長，如下圖（左圖）所示。請注意，由于在發射前存在部分能量損失，盡管發射波長與激發波長無關（如上所示），但發射強度與激發波長的振幅成正比，如下圖（右圖）(2) 中的激發能量（Ex 1 和 Ex2）及其相應的發射強度（分別為 Em1 和 Em2）所示。

熒光基團的激發和發射光譜以及激發振幅和發射強度之間的相關性。熒光基團激發和發射光譜的總圖（左）。發射光的強度（Em1 和 Em2）與激發任何激發波長（分別為 Ex1 和 Ex2；右）的熒光基團所需的能量成正比。

斯托克斯位移

激發和發射波長之間的距離稱為斯托克斯位移（參見下文），是生物學應用中檢測發射熒光的關鍵方面。斯托克斯位移也是每個熒光基團的明顯特征。例如，當使用斯托克斯位移很小的熒光基團（右圖）時，對發射熒光進行檢測可能很難區分激發光，因為激發和發射波長在較大程度上存在重疊。相反，由于激發波長與發射波長之間存在很大分離，很容易區分具有較大斯托克斯位移的熒光基團（左圖）。斯托克斯位移在多通路熒光應用中尤為關鍵，因為一個熒光體的發射波長可能會重疊，因此會激發同一樣品中的另一個熒光體。

熒光基團激發和發射光譜的斯托克斯位移。具有較高斯托克斯位移的熒光基團（左）顯示樣品中激發光和發射光之間存在清晰區分，而對于斯托克斯位移較小的熒光基團（右），由于激發和發射波長之間的差異較小，則顯示更高的背景信號。

顏色范圍

電磁頻譜指各種電磁輻射波長的較大范圍，可見光光譜僅限于這些波長中極小的子集，如下所示。由于對超出可見光譜進行檢測時存在限制，因此基于熒光的早期研究應用采用僅在電磁光譜可見光范圍 (390 – 700 nm) 中發射的熒光基團。依賴于如今的技術進步，人們能夠檢測出可見光譜邊界以外的熒光基團，并檢測到電磁光譜的紫外 (UV) 和紅外 (IR) 范圍。這些新型熒光基團和檢測器為全新和開發的應用提供了更出色的可變性、多功能性和多重檢測能力。

指示近似波長的可見光光譜。

熒光基團亮度

特定熒光基團的亮度由摩爾消光系數和量子產率確定，兩者均具有特異性。摩爾消光系數 (ε) 定義為在給定波長下可以被熒光吸收的光量（測量單位：M^-1 cm^-1）。量子產率 (Φ) 的計算方式為熒光發射的光子數量除以吸收的光子數量。熒光基團亮度的計算方式為將 ε 和 Φ 相乘。

熒光基團種類

盡管熒光化學以及技術發現的發展推動了多種不同類型熒光基團的開發，但近 100 年來的生物研究仍然使用了熒光。大量的熒光基團可以為研究應用提供比以往任何時候更高的靈活性、變異性和熒光基團性能。熒光染料可分為三組通用組：

· 有機染料

· 生物熒光基團

· 量子點

每個熒光基團都具有不同的特征，在決定使用哪種熒光基團用于給定的應用或實驗系統時，應考慮這一點。

有機染料

熒光素等合成有機染料，是生物學研究中使用的熒光化合物。已對此類原始化合物的衍生物進行加工，以提高其光穩定性和溶解度。還針對此類染料開發了衍生物，用于生物偶聯，特別是異硫氰酸熒光素 (FITC)、羅丹明（四甲基羅丹明異硫氰酸鹽，TRITC）和具有更高性能的市售類型。對于生物偶聯策略而言，這些熒光體的小尺寸是優于生物偶聯熒光基團的優勢，因為它們可以與抗體、生物素或親和素大分子交聯，而不會干擾正常的生物學功能。具有特征激發/發射光譜和量子產率和激發系數的多種染料，可市售用于任何熒光應用。

生物熒光基團

雖然人們已在千年前了解到存在生物發光，但研究應用中的生物熒光基團的使用發生在 1990 年代，當時綠色熒光蛋白 (GFP) 由維多利亞多管發光水母克隆而來，作為基因表達報告基因 (3)。自此，原 GFP、藻膽蛋白（別藻藍蛋白、藻青蛋白、藻紅蛋白和藻膽蛋白）以及許多其他蛋白均被設計用于生物表達系統，它們的使用現在在生物研究中已經十分常見。

這類熒光基團的優點在于可將表達質粒引入細菌、細胞、器官或全生物中，以驅動該熒光基團單獨表達或在研究的生物過程背景下融合至目標蛋白的表達。使用熒光蛋白可能很耗時，表達將大量產生光蛋白，該蛋白可能會產生活性氧簇，并誘導實際反應或毒性。此外，熒光蛋白的大小可以改變熒光基團融合到的細胞蛋白的正常生物學功能，生物熒光基團通常不會具有合成熒光染料所具有的光穩定性和靈敏度水平。

量子點

量子點是具有化學特性的納米晶體，可嚴格控制熒光體的光譜特性。量子點于 1980 年代開發，自 1990 年代以來，已越來越多地用于生物研究的熒光應用。量子點是納米級尺寸 (2-50 nm) 的半導體，在激發時，會根據顆粒的大小發射某一波長的熒光；相較于大量子點，較小的量子點會發射更高的能量，因此隨著納米晶體尺寸的增加，發射光從藍色轉換為紅色。由于量子點大小可以嚴格控制，因此與其他熒光體相比，對于不同的激發和發射波長具有更高的特異性。 

使用 Qdot 二抗偶聯物進行多色免疫熒光成像小鼠腎層粘連蛋白被標記上抗層粘連蛋白一抗，用綠色熒光素 Qdot 565 IgG 顯色。血小板/內皮細胞黏附分子（PECAM 又名 CD31）被標記為抗 PECAM-1一抗，用紅色熒光 Qdot 655 IgG 顯色。細胞核使用藍色熒光素 Hoechst 33342 染色

據報告，量子點比其他熒光基團更具光穩定性，因為一份報告顯示，量子點在可在體內成像研究中保持 4 個月的熒光狀態 (1)。此外，量子點可以包被用于蛋白標記等不同生物學應用。雖然在生物應用中對量子點的使用處于上升狀態，但由于顆粒的分解 (4)，據報告存在細胞毒性，并且其使用成本過高。

熒光檢測和定量

檢測策略

我們開發了多種不同類型的熒光檢測儀器，雖然每種儀器僅適用于都不同的實驗方法，但所有熒光檢測儀器都具有四種基本要求：

· 激光、光電二極管或燈（氙弧燈和汞蒸汽燈最為常見)等激發光源

· 熒光基團

· 用于分離特定波長以激發不同熒光基團的濾光片

· 記錄輸出（通常是電子信號）的探測器

雖然此列表并不詳盡，并且我們還在不斷開發新儀器，但常見的熒光檢測儀器包括以下儀器：

· 熒光顯微鏡 – 檢測樣品二維和三維的局部熒光劑

· 微陣列讀數儀等熒光掃描儀 – 檢測樣品在兩維的局部熒光劑

· 分光光度計和酶標儀 – 記錄樣品中的平均熒光

· 流式細胞儀 – 分析樣品群中單個細胞的熒光

定量

隨著數字顯微鏡的出現，已能夠在在所有熒光應用中普遍發現熒光信號定量的存在，并且能夠測量以下各種參數：

· 細胞計數

· 定位于細胞或甚至離散細胞區室的熒光基團量

· 基因表達率和蛋白合成率

· 細胞運動速率或細胞內組分的移動速率

· 樣品中的 DNA 量、RNA 量或蛋白量

· DNA、RNA 或蛋白序列

· 酶活性

· 存活率

根據實驗方法，熒光定量需要專用軟件，可能需要熒光標準品來校準儀器。

熒光標記

熒光標記是將熒光基團共價連接到其他蛋白或核酸等分子的過程。這通常通過使用熒光基團的反應性衍生物實現，該熒光基團可選擇性地與靶分子中的官能團結合。最常標記的分子是抗體，抗體可用作檢測特定靶標的特異性探針。熒光標記可應用于各種檢測系統，并可以進行靈敏和定量測量。

熒光基團偶聯

標記分子需要熒光基團的化學反應性衍生物。常見反應性基團包括胺反應性異硫氰酸鹽衍生物，包括 FITC、胺反應性琥珀酰亞胺酯，例如 NHS 熒光素或 NHS 羅丹明以及巰基反應性馬來酰亞胺活化熒光劑（例如：熒光素-5-馬來酰亞胺）。這些反應性染料與另一種分子的反應可形成熒光基團與標記分子之間的穩定共價鍵。異硫氰酸酯長期以來一直用作主要反應性化學試劑，通過賴氨酸側鏈的一級胺將熒光染料與蛋白連接。NHS 酯化學試劑現在是標記方法，因為其對一級胺具有更高的特異性，并在標記程序后產生更穩定的鍵。巰基反應性化學組成在蛋白質標記中的應用范圍較小，主要適用于需要保留賴氨酸殘基或特異性靶向半胱氨酸殘基以在標記蛋白上定位熒光染料的情況。

NHS 熒光素和 FITC 的結構；熒光素的兩種胺反應性衍生物。

NHS 光素通過 N羥基琥珀酰亞胺（NHS 酯）官能團激活。與 FITC 相比，NHS 衍生物在存在其他親核試劑的情況下對一級胺具有更高的特異性，并在標記后產生更穩定的鍵。

NHS 熒光素和 FITC 的比較。

使用熒光素標記的二抗檢測 α 微管蛋白。A549 人肺癌細胞在 96 孔微孔板中生長 18 – 20 小時，使用 4% 多聚甲醛（貨號：28906）固定，并使用 0.1% Surfact-Amps X-100（貨號：28314）透化處理。使用小鼠抗 α 微管蛋白一抗 (0.4 μg/mL) 和熒光素山羊抗小鼠二抗 (2 µg/mL) 通過探針對細胞進行探查。使用 Hoechst 染料對細胞核進行標記。圖像通過熒光顯微鏡采集。A. 熒光圖像顯示了僅位于細胞質中的α 微管蛋白（偽彩綠色）的精細網絡。B. 使用 Hoechst 染料進行核復染（偽彩藍色）C. 合并圖像。

為檢測熒光信號，分子必須被充分標記，同時不干擾分子的功能、溶解性、結合能力或激活性等正常生物特性。因此，熒光標記需要優化。

去除未反應的熒光基團

完成熒光標記反應后，通常需要從標記的靶標分子中去除所有未反應的熒光基團。這通常通過尺寸排除色譜法實現，利用熒光基團、標記蛋白以及核酸等之間的大小差異。然而，許多熒光基團與常規的分離基質相互作用，會導致回收率和分離效果不佳。因此，考慮熒光染料疏水特性的專用染料去除柱。使用市售染料去除柱，可以從小至 7kDa、大至 150 kDa IgG 的蛋白中去除染料分子。

影響熒光發射或檢測的因素

淬滅

熒光基團發射可直接受其他熒光或非熒光分子的相互作用影響，而后者可以"猝滅"激發熒光基團發出的熒光。由于可在生物學事件的響應中添加或去除淬滅劑，因此熒光淬滅通常用于確定蛋白的激活狀態或識別基因表達。

淬滅程度取決于淬滅劑分子的性質（熒光基團或非熒光基團）、相互作用類型以及熒光體發射的能量波長。熒光猝滅的方法包括熒光共振能量轉移 (FRET)、碰撞猝滅和接觸猝滅，通過以下圖表表示。

在 FRET（也稱為 F?rster 共振能量轉移）中，激發光將"供體"熒光體提高到激發狀態，從而導致光子釋放。"受體"分子可以是另一個熒光體或非熒光分子，與供體熒光體足夠接近，以吸收發射的光子，然后在非熒光分子情況下有效淬滅發射的光。當使用熒光體作為淬滅劑時，發射的光子也會被淬滅，并且如果吸收的光子位于第二熒光體的激發波長范圍內，受體電子將被提升至激發狀態并在受體熒光體波長處釋放光子。另一種作為淬滅劑的熒光體通常用于檢測供體熒光體的淬滅狀態，因為熒光體并非在應答供體熒光體的激發時檢測已知波長的熒光，而是在淬滅熒光體的波長處發射淬滅熒光。

FRET 光譜重疊積分的示意圖。該過程是兩種染料分子在電子激發狀態下之間的距離依賴性相互作用，其中激發作用從供體分子轉移至受體分子，而不發射光子。

表 1.Forster Radius 的 R0 典型值 – 注意： Forster 中 O 的上方有兩個圓點

接觸猝滅發生于激發前熒光基團與淬滅分子復合時；由于熒光體與其他分子直接接觸，激發產生的能量立即轉移到接觸分子，并以熱的形式耗散。碰撞淬滅發生于激發熒光基團與溶液中的淬滅劑反應時，能量立即轉移到接觸的分子，激發熒光體隨之弛豫。

熒光淬滅類型圖。

背景熒光

在特定實驗中，熒光基團檢測可能會被高背景熒光干擾，這通常是由于未清除未結合的熒光探針或樣品自發熒光引起。清洗樣品或減少熒光探針的濃度可以降低背景熒光。但是，針對自發熒光問題（定義為樣品中組分的內源性熒光），需要考慮正確的探針組合或設備。生物樣品中的自發熒光通常在使用較短波長激發光（通常 <500 nm）時發出。因此，可以使用不激發與樣品相同光譜的熒光體或濾光片組（專用于將激發光縮小至靶熒光染料的激發光），從而盡可能減少或避免自發熒光。

低熒光

低熒光強度可限制靶熒光基團的檢測，在背景熒光較高時尤為如此。熒光強度可通過增加靶位點上的熒光分子數量而增強。這可以通過在實驗或擴增方法中使用更高濃度的探針來完成，以增加熒光基團在靶位點的定位。由于增加探針濃度可能會沉淀探針分子并導致細胞畸變（細胞內探針則更為嚴重）或自淬滅（因為分子間相互作用水平高；參見上文“淬滅"部分）或誘導細胞死亡，因此兩種方法都可以對信號檢測產生負面影響。

除了累積熒光探針數量外，由于激發強度與激發能量成正比，有時也可通過增加激發光強度來增強低熒光強度。但如下文所述，使用這種方法必須達到平衡，避免熒光褪色。

光漂白

光漂白是熒光團基團因長時間暴露在激發光源下或高強度激發光下發生不可逆破壞的現象。通過將熒光體暴露于可能的極低激發光強度水平，以盡可能縮短或避免光漂白同時還實現信號檢測；這需要使用高靈敏度 CCD 相機、高數值孔徑物鏡和/或超寬帶帶通發射濾光片優化檢測方法。其他方法包括使用比傳統熒光基團更穩定的光基團和/或使用抗淬滅劑保護熒光體免受光漂白。避免光漂白的步驟并不適用所有檢測方法，應該針對每種方法進行優化。例如，Intifada 試劑對活細胞具有毒性，因此只能用于固定細胞或組織。此外，由于熒光基團在激發源下的曝光時間極短，因此流式細胞術等部分檢測方法，通常無需設置避免光漂白的步驟。以下示例說明了熒光光光漂白現象。

Invitrogen Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546 染料、熒光素和 Cy3 熒光基團針對光漂白率的對比。牛肺動脈內皮細胞 (BPAEC) 的細胞骨架分別使用 Alexa Fluor® 488鬼筆環肽（上系列）、小鼠單克隆抗 α 微管蛋白抗體及 Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG 抗體標記或熒光素鬼筆環肽（下系列）、抗 α 微管蛋白抗體及市售的 Cy3 標記的山羊抗小鼠 IgG 抗體標記。偽彩圖像每隔 30 秒拍攝（0、30、90、210 秒曝光）。圖片通過適合熒光素和羅丹明的帶通濾色片獲得。

推薦閱讀：

1. Ballou B. et al.(2004) Noninvasive imaging of quantum dots in mice.Bioconjug Chem.15, 79-86.

2. Encyclopedia of Chromatography: J. Cazes (Ed.); Marcel Dekker Inc., New York, 2001

3. Chalfie M. et al.(1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science.263, 802-5.

4. Mahendra S. et al.(2008) Quantum dot weathering results in microbial toxicity.Environ Sci Technol.42, 9424-30.

#熒光探針# #熒光基團# #蛋白質生物學# #生物研究#

賽默飛世爾科技（中國）有限公司