諾博萊德 酵母高純質(zhì)粒小提試劑盒 核酸提取

HiPure Yeast Plasmid Mini Kit酵母高純度質(zhì)粒小量快速提試劑盒

目錄號：31016

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：

在室溫(15~25℃)干燥條件下，可保存12個月。加入 RNase A后的溶液 P1 應置于 2 ~ 8℃保存，可穩(wěn)定保存6 個月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新補加即可。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒用于高純度酵母質(zhì)粒 DNA 的小量制備。菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低 pH 處理，質(zhì)粒可從菌體中釋放出來，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過清洗液的洗滌可去除雜質(zhì)，在低鹽、高 pH 條件下洗脫，最后得到純度較高的質(zhì)粒 DNA。所得質(zhì)?？芍苯佑糜诿?span style="font-size: 16px; font-family: 宋體, SimSun; letter-spacing: 0px;">切、轉(zhuǎn)化、PCR、RT-qPCR、測序及轉(zhuǎn)染等分子生物學實驗。

注意事項：

1.   通常酵母的拷貝數(shù)都很低，高拷貝最大得率一般為每 5 ml 培養(yǎng)物提取 1μg 左右的質(zhì)粒。用于下游試驗時通常建議使用量為： 1-5μl 用做 PCR 模板;5-10μl 用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌,選擇高效率的感受態(tài)細胞。

2.   用戶需要自備 Sorbitol buffer( 1M 山li醇，0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。配制方法：在 600 ml 去離子水里面溶解182.2克山li醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié) PH 值，定容到 1L，4℃保存。臨用前加 0.1%β-巰基乙醇(商品化的 β-巰基乙醇摩爾濃度一般為 14M)。

3.   使用前請先檢查平衡液、溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。 
      4.   溶液YP1，YP2 和YP3 的用量比例，若細菌量增大，需按比例放大這些溶液的使用量；重要提示：

一、第一次使用前請先漂洗液 WB 中加入無水乙醇（詳見瓶身標簽），混勻，并做好標記。
       二、首ci使用時請先將 RNase A 全部加到溶液 YP1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。
      三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巰基乙醇，回復到室溫備用。

操作步驟：

1.取 1.5-5 毫升酵母培養(yǎng)物(不超過 5x 107 cells)，9,000rpm 離心 30 秒，盡可能的吸棄上清，收集菌體。

（注意： 如果用 50ml 離心管收集菌體，可以離心棄上清后，在同一管內(nèi)加入更多的菌液，重復步驟 1，直到收集到足夠多的菌體）

2.    加入 600μl Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；可按照 20-50U/1x107 cells 的比例加入 Lyticase(一般 5 ml 培養(yǎng)物可能需要加到 200U)，充分顛倒混勻，37℃溫育至少 30分鐘消化細胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化。

（注意：如果破壁效果不好導致質(zhì)粒產(chǎn)量低，可以加大 lyicase 用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間來提高效果，不適合 Lyticase 消化的酵母可選用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠渦旋，反復凍融等。）

3.   13,000rpm 離心 1 min，盡可能吸棄上清，加入 250 ul 溶液YP1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至徹di懸浮。

（注意：如有未徹di懸浮的菌塊會影響裂解，導致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

4.  加入 250 ul 溶液YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時間不要超過 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞，如未完quan變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 YP3 的用量也要相應增加）

5.加入 350 ul 溶液 YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀，

然后室溫 13,000 rpm 離心 10 min。

（注意：加入溶液 YP3 后應立即混合，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀）

6.   將上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫 12,000 rpm 離心 1 min，質(zhì)粒被吸附在膜上，棄濾液。

7.    可選步驟：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室溫 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒。如果提取低拷貝質(zhì)粒也推薦采用此步驟）

8.加入 600 ul 漂洗液 WB，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

9.    重復步驟 8 一次。

10.   室溫 12,000 rpm 離心 2 min，甩干殘留液體。

（注意：此步不能省略，否則殘留乙醇會影響質(zhì)粒的后續(xù)使用）

11. 將吸附柱置于一個新的 1.5 ml 離心管（自備）中，加入 50 ~ 100 ul 的洗脫緩沖液 EB，室溫放置 2 min，12,000 rpm 離心 1 min，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預熱洗脫緩沖液 EB，可增加洗脫效率；如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調(diào)整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間。）

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