在生物醫學研究領域，永生化小鼠胚胎囊性纖維化成纖維細胞 - Ras（Immortalized Mouse Embryonic Cystic Fibrosis Fibroblasts - Ras）是一種具有價值的細胞模型，為深入探究相關疾病機制及藥物篩選提供了有力支持。以下是關于該細胞系操作使用的詳細指南。

一、細胞培養條件

（一）培養基配制

該細胞系通常使用改良 Eagle 培養基（DMEM）進行培養，需在培養基中添加 10% 胎牛血清（FBS），以提供細胞生長所需的營養物質、激素和生長因子等，還需添加 1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗溶液，防止細胞培養過程中的細菌和真菌污染。

（二）培養環境

細胞培養應在 37℃、5% CO?的恒溫培養箱中進行，這樣的環境有助于維持培養基的 pH 值穩定，并為細胞提供適宜的生長溫度和氣體條件，以模擬體內生理環境，確保細胞的正常生長和代謝。

二、細胞傳代操作

（一）傳代比例

一般建議將細胞以 1:2 至 1:3 的比例進行傳代培養。當細胞生長至覆蓋培養瓶底面積的 80%-90% 時，即可進行傳代操作，以防止細胞過度擁擠導致生長抑制和細胞狀態下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液進行細胞消化。在消化過程中，需密切觀察細胞形態變化，一般在 37℃下消化 1-2 分鐘，待細胞間隙增大、細胞邊緣變圓并開始從培養瓶壁上脫落時，立即加入含血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞使其全脫落并形成均勻的細胞懸液，然后進行分瓶培養。

三、細胞凍存與復蘇

（一）細胞凍存

1. 凍存培養基配制 ：凍存培養基一般由基礎培養基、胎牛血清（FBS）和二甲基亞砜（DMSO）組成，比例為 50% 基礎培養基 + 40% FBS + 10% DMSO。DMSO 是一種常用的細胞凍存保護劑，可降低細胞內外溶液的冰點，減少細胞內水分結冰對細胞造成的損傷。

2. 凍存操作 ：將細胞收集并離心，棄去上清液，用凍存培養基重懸細胞，調整細胞密度至 1×10^6^ cells/mL 左右，將細胞懸液分裝于凍存管中，每管 1 mL。將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱中過夜，次日轉移至液氮中長期保存。緩慢降溫的過程有助于細胞逐漸適應低溫環境，減少細胞內冰晶的形成，從而提高細胞復蘇后的存活率。

（二）細胞復蘇

1. 快速解凍 ：從液氮中取出凍存管，立即放入 37℃水浴中快速搖動，使細胞在 45-90 秒內全解凍。快速解凍可使細胞迅速通過最易受損的溫度區域，減少細胞在低溫條件下受凍的時間，降低細胞受損程度。

2. 細胞處理 ：將凍存管從水浴中取出后，用 70% 酒精消毒管外壁，移入無菌超凈工作臺內。將凍存管中的細胞懸液全部轉移到含有 9 mL 培養基的離心管中，用移液管輕輕吹打混勻，使凍存管中的 DMSO 濃度稀釋至 10% 以下，以減少 DMSO 對細胞的毒性作用。然后在 300×g 的離心力下離心 3 分鐘，棄去上清液，加入適量培養基重懸細胞，將細胞接種于培養瓶中，放入 37℃、5% CO?培養箱中培養。

四、細胞基因改造機制

該細胞系是通過將 Ras 基因導入小鼠胚胎囊性纖維化成纖維細胞而獲得永生化。Ras 基因是一種原癌基因，可編碼 21kD 的 GTP 酶。正常細胞中，Ras 蛋白處于活性狀態時，能夠結合 GTP 并激活下游的信號通路，如 MAPK 信號通路，參與細胞生長、分化、凋亡等生理過程的調控。而在該細胞系中，Ras 基因的異常表達或激活可破壞細胞正常的生長調控機制，使細胞獲得無限增殖的能力，從而實現永生化。

五、細胞應用

（一）疾病研究模型

永生化小鼠胚胎囊性纖維化成纖維細胞 - Ras 是研究囊性纖維化疾病的重要細胞模型。通過在體外模擬囊性纖維化的病理環境，可深入探究該疾病的發生發展機制，如細胞的異常增殖、凋亡抗性以及與炎癥反應等的關系，為開發針對性的治療方法提供理論基礎。

（二）藥物篩選

該細胞系可用于高通量藥物篩選，用于篩選能夠調節細胞增殖、誘導細胞凋亡或改善囊性纖維化相關病理特征的藥物。由于細胞具有永生化特性，可在較長時間內穩定地進行藥物處理和實驗觀察，提高了藥物篩選的效率和可靠性。