細(xì)胞復(fù)蘇操作

• 準(zhǔn)備培養(yǎng)基和耗材 ：提前準(zhǔn)備好適合永生化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如含有 5-10v/v% 胎牛血清、10-100IU/ml 青霉素、10-100μg/ml 鏈霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)基等，同時(shí)準(zhǔn)備好 PriCoat™ECM T25 培養(yǎng)瓶或 Applied Cell 細(xì)胞外基質(zhì)涂層的培養(yǎng)瓶。

• 取出凍存細(xì)胞 ：從液氮罐或 - 130°C 以下的保存環(huán)境中取出凍存的永生化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，迅速放入 37°C 水浴中快速解凍，輕輕搖晃使其均勻受熱，直到凍存管內(nèi)的干冰全溶解。

• 細(xì)胞處理與培養(yǎng) ：將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，然后進(jìn)行離心，去除凍存液。再用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻分布，放入 37.0°C、5% CO? 的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代操作

• 觀察細(xì)胞狀態(tài) ：在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶壁的 80%-90% 時(shí)，即可進(jìn)行傳代操作。

• 細(xì)胞消化與收集 ：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，加入適量的 PBS 清洗細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入胰蛋白酶消化液，在 37°C 下孵育 1-2 分鐘，觀察細(xì)胞是否從瓶壁脫落。當(dāng)細(xì)胞大部分脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行離心收集細(xì)胞。

• 細(xì)胞計(jì)數(shù)與接種 ：對(duì)離心后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)需要的傳代比例，將細(xì)胞懸液按適當(dāng)?shù)谋壤臃N到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮的培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存操作

• 準(zhǔn)備凍存液和凍存管 ：凍存液一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清和 DMSO 按一定比例配制而成，如含 90% 胎牛血清和 10% DMSO 的凍存液。準(zhǔn)備好標(biāo)記好細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期等信息的凍存管。

• 細(xì)胞收集與處理 ：將培養(yǎng)好的永生化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞用胰蛋白酶消化并收集，離心去除培養(yǎng)基和消化液，用凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至適當(dāng)濃度，一般為 1×10^6 cells/ml 左右。

• 細(xì)胞分裝與凍存 ：將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，每管 1-2ml。將凍存管放入 - 80°C 冰箱中預(yù)凍 2-4 小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存。在凍存過(guò)程中，要盡量保持溫度的均勻下降，以減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成對(duì)細(xì)胞的損傷。