實驗設計、審稿人質疑、審計核查，所有環節都繞不開一句“請提供技術參數"。下面把這支細胞株的核心指標拆到最小顆粒度，逐項給出可溯源的數值、測定方法和出處，讓任何實驗室都能直接引用或復現。

基因組編輯痕跡

HPV16-E6/E7 插入位點

慢病毒載體采用 pLVX-EF1α-E6-IRES-E7-Puro，整合位點通過 LAM-PCR 捕獲，測序定位 chr3:128,456,789 與 chr12:58,321,007。兩份全基因組測序文件已上傳至 CNGBdb（項目號 CNP0004381），下載后可自行比對斷點序列。

拷貝數

數字 PCR 顯示每個細胞 2.1 ± 0.3 個整合片段，拷貝數穩定至第 30 代。實驗室自檢可使用 Bio-Rad QX200，引物序列見附錄 S1。

表型保持閾值

平滑肌標志物表達量

第 5 代、第 15 代、第 25 代的 qPCR 結果：

• α-SMA 轉錄水平保持原代細胞的 87 %、84 %、82 %

• SM22α 轉錄水平保持 90 %、88 %、85 %

抗體選用 Sigma A2547 與 Abcam ab14106，流式平均熒光強度 CV < 6 %。

收縮功能

96 孔膠原凝膠收縮實驗，Ang II 刺激 15 min 后面積收縮率 31 ± 4 %，與原代 38 ± 3 % 差距在統計學置信區間外。

生長動力學

倍增時間

培養基（DMEM + 10 % FBS + 1 % ITS + 5 µg/mL puromycin）37 °C、5 % CO? 下，倍增時間 26.4 ± 1.2 h。使用 IncuCyte S3 每 2 h 拍照一次，Logistic 擬合 R2 > 0.99。

飽和密度

100 mm dish 峰值密度 1.8 × 10^5 cells/cm2，超過此密度 24 h 內凋亡率上升至 12 %。

穩定性與極限傳代

極限代次

連續培養至第 45 代，核型分析 20 個中期相，未見非整倍體或染色體碎裂。端粒長度 qPCR 檢測，第 45 代端粒 T/S 比值仍高于原代 1.9 倍，提示永生化機制持續有效。

表型漂移監測

建立內部參考標準：每 5 代做一次 STR + 標志物 + 收縮功能三合一檢測，任一項偏差超過 10 % 即淘汰該批次。

藥篩與基因編輯兼容性

抗生素敏感性

Puromycin 篩選曲線測定：IC?? 0.72 µg/mL，推薦維持濃度 1 µg/mL，篩選效率 100 %。

Blasticidin、Hygromycin 交叉耐受實驗顯示 IC?? 均 > 15 µg/mL，可做多基因共轉染。

CRISPR 敲除效率

電轉 1.5 µg Cas9-sgRNA RNP，72 h T7E1 檢測，INDEL 頻率 78 %。單細胞克隆形成率 35 %，與 HEK293 水平相當。

支原體、細菌、真菌三維質控

檢測方法組合

• 支原體：qPCR（Takara）+ 培養法（PPLO broth）雙陰性

• 細菌：BHI 培養 14 d，無渾濁

• 真菌：SDA 培養 14 d，無絲狀或酵母樣菌落

報告隨貨同行，存檔編號與批次號綁定，支持掃碼追溯。

凍存與復蘇參數

凍存液配方

90 % FBS + 10 % DMSO，梯度降溫盒 –1 °C / min 至 –80 °C，24 h 后轉入液氮。復蘇存活率 92 ± 3 %，臺盼藍法測定。

批次一致性

隨機抽取 10 批次凍存管，復蘇后倍增時間 CV < 5 %，STR 匹配度 100 %。

附：可直接引用的標準語句

“實驗使用的人腸平滑肌細胞經 HPV16-E6/E7 永生化，STR 檢測與參考株 100 % 匹配，支原體、細菌、真菌三重陰性，第 15 代 α-SMA 表達量為原代 84 %，Ang II 誘導收縮率 31 %，倍增時間 26.4 h。"