非蛋白質巰基（NPSH）檢測操作使用指南

時間：2026/1/28閱讀：460

一、NPSH檢測原理簡述

非蛋白質巰基（Non-protein Sulfhydryl, NPSH）是生物樣本中不與蛋白質結合的游離巰基化合物統稱，包括谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸等，在抗氧化、解毒等生理過程中發揮重要作用。檢測NPSH常用顯色反應法，核心原理是利用巰基（-SH）的還原性，與特定試劑發生化學反應生成有色產物，通過測定產物吸光度實現定量。

常用的試劑為5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），其在堿性條件下與巰基反應，生成黃色的2-硝基-5-巰基苯甲酸（TNB），該產物在412nm波長處有特征吸收峰，吸光度與NPSH濃度呈線性關系，可通過分光光度法計算樣本中NPSH含量。

二、實驗前準備

1. 試劑準備

DTNB溶液：稱取適量DTNB粉末，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 8.0）溶解，濃度通常為0.1-0.5 mM。DTNB易被氧化，需現配現用或分裝后-20℃避光保存，避免反復凍融。
緩沖液：常用PBS（pH 7.4-8.0）或Tris-HCl緩沖液（pH 8.0），用于維持反應體系pH穩定，需提前配制并滅菌（0.22μm濾膜過濾），4℃保存不超過1周。
標準品：選擇還原型谷胱甘肽（GSH）作為標準品，用緩沖液配制系列濃度（如0-200 μM），現配現用，避免久置氧化。
樣本預處理試劑：根據樣本類型選擇，如細胞樣本需裂解液（含EDTA抑制金屬離子氧化巰基），組織樣本需勻漿緩沖液，血清樣本可直接稀釋。

2. 儀器與耗材準備

分光光度計：需支持412nm波長，使用前預熱30分鐘，校準波長準確性（可通過標準溶液驗證吸光度穩定性）。
離心機：用于樣本預處理（如細胞裂解后離心去沉淀，轉速通常10000-12000 rpm，離心時間5-10分鐘）。
移液器與耗材：10-1000 μL量程移液器（校準誤差≤2%），無菌離心管（1.5 mL）、96孔板（石英或聚苯乙烯材質，確保412nm透光性）。

三、具體操作步驟

1. 樣本預處理

細胞樣本：收集對數期細胞，PBS洗滌2次，加入含1% Triton X-100的裂解液（含5 mM EDTA），冰上裂解30分鐘，12000 rpm離心10分鐘，取上清液待測（上清需無沉淀，避免干擾吸光度）。
組織樣本：取新鮮組織（如肝臟、腎臟），用預冷PBS洗凈-血-漬-，剪碎后按1:5（質量體積比）加入勻漿緩沖液，冰浴勻漿2分鐘，10000 rpm離心15分鐘，取上清待測。
血清/血漿樣本：無需裂解，直接用PBS按1:5-1:10稀釋（根據預期NPSH濃度調整稀釋倍數，避免吸光度超出標準曲線線性范圍）。

2. 標準曲線制備

在96孔板中，依次加入標準品溶液（0、20、50、100、150、200 μM GSH）各50 μL，每組3個復孔。
每孔加入DTNB溶液50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應15分鐘（反應時間需嚴格控制，過長可能導致非特異性反應）。

3. 樣本測定

在96孔板中加入樣本上清液50 μL，同樣加入50 μL DTNB溶液，37℃避光反應15分鐘（與標準曲線同步反應）。
反應結束后，立即用分光光度計在412nm波長下測定各孔吸光度（空白孔為“緩沖液+DTNB"，用于扣除背景）。

4. 數據計算

以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（線性回歸方程：y = ax + b，R2需≥0.99）。
根據樣本吸光度（扣除空白后）代入方程，計算樣本中NPSH濃度，再根據樣本稀釋倍數和樣本量（如細胞數、組織質量）換算為“nmol/mg蛋白"或“μmol/L"等最終單位。

四、關鍵注意事項

試劑穩定性：DTNB溶液暴露于強光或高溫下易分解，配好后需用錫箔紙包裹容器，4℃保存不超過24小時；GSH標準品溶液需現配，若發現溶液變黃（氧化為GSSG），需重新配制。
樣本時效性：巰基易被空氣中的氧氣氧化，樣本處理需在冰上操作，離心后立即測定；若無法立即檢測，可加入還原劑（如1 mM DTT）暫時保護，但需扣除DTT本身對巰基檢測的干擾。
操作環境：避免在通風櫥強氣流下操作（可能加速巰基氧化），反應體系pH需嚴格控制在8.0左右（pH過高會導致DTNB自身水解，pH過低則反應速率減慢）。
儀器校準：分光光度計使用前需用標準溶液（如重鉻酸鉀溶液）校準波長，確保412nm處吸光度準確；96孔板需選擇無劃痕、透光均勻的板，避免因板間差異導致誤差。

五、常見問題及處理

吸光度為負值：可能是空白孔吸光度高于樣本孔，需檢查空白組是否僅含緩沖液+DTNB，或樣本中存在強氧化劑（如H?O?）破壞巰基，可在樣本中加入少量還原劑（如1 mM抗壞血酸）中和。
標準曲線線性差：多因標準品配制誤差（如移液不準確）或反應時間不一致，建議使用校準過的移液器，且所有孔同時加入DTNB并計時反應。
重復性差：可能是樣本勻漿或裂解不均勻，需確保組織勻漿充分（可通過鏡檢確認無明顯組織碎片），細胞裂解后離心時間足夠（避免沉淀干擾）。