什么是活性氧（ROS）

活性氧，英文縮寫為ROS，是一類具有高化學(xué)反應(yīng)活性的含氧分子或離子的統(tǒng)稱。它們通常是氧氣在體內(nèi)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，既包括自由基形式，如超氧陰離子（O??·）、羥基自由基（·OH），也包括非自由基形式，如*（H?O?）、單線態(tài)氧（1O?）等。這些分子由于其未配對(duì)的電子或特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生反應(yīng)。

ROS的主要生成機(jī)制

細(xì)胞內(nèi)ROS的生成是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)密調(diào)控的過(guò)程。

線粒體是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。在有氧呼吸過(guò)程中，約有1-2%的氧氣在線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈中發(fā)生不-完-全-還原，泄露的電子與氧氣結(jié)合形成超氧陰離子。這一過(guò)程與呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ的功能狀態(tài)密切相關(guān)。

NADPH氧化酶（NOX）家族是另一重要的ROS來(lái)源。這類酶主要存在于吞噬細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）的細(xì)胞膜上，當(dāng)細(xì)胞受到病原體或特定刺激激活時(shí)，NOX會(huì)將電子從NADPH轉(zhuǎn)移給氧氣，生成超氧陰離子，參與機(jī)體的免疫防御。除了吞噬細(xì)胞，非吞噬細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中也存在NOX的不同亞型，它們產(chǎn)生的ROS在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。

此外，黃嘌呤氧化酶在催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸的過(guò)程中，也會(huì)伴隨超氧陰離子和*的產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)的一些酶反應(yīng)，如細(xì)胞色素P450氧化酶系統(tǒng)、脂氧合酶和環(huán)氧合酶的催化反應(yīng)，也可能作為ROS的來(lái)源。

ROS的生理功能與病理意義

在生理濃度下，ROS并非-完-全-有害，而是作為重要的信號(hào)分子參與多種細(xì)胞生理過(guò)程。例如，ROS可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等信號(hào)通路。在免疫反應(yīng)中，吞噬細(xì)胞通過(guò)“呼吸爆發(fā)"產(chǎn)生大量ROS，用于殺滅入侵的病原體。ROS還參與血管張力的調(diào)節(jié)，如NO的生成與滅活過(guò)程就與ROS密切相關(guān)。

當(dāng)ROS的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量積累時(shí)，就會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激。過(guò)量的ROS會(huì)攻擊生物大分子：氧化脂質(zhì)可導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低、通透性改變，甚至引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；氧化蛋白質(zhì)會(huì)使其結(jié)構(gòu)改變、功能喪失，影響酶活性和信號(hào)傳導(dǎo)；氧化DNA則可能導(dǎo)致堿基修飾、鏈斷裂等損傷，增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥以及衰老過(guò)程本身。

ROS檢測(cè)的基本原理與方法分類

準(zhǔn)確檢測(cè)ROS水平是研究其生理病理作用的基礎(chǔ)。由于ROS化學(xué)性質(zhì)活潑、半衰期短，檢測(cè)具有一定挑戰(zhàn)性。

常用的檢測(cè)方法基于不同的原理。分光光度法是利用ROS與特定顯色劑反應(yīng)后產(chǎn)生的顏色變化進(jìn)行定量，例如硫代-巴-比-妥-酸法（TBA法）檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA），間接反映ROS水平。

熒光探針?lè)▌t因其靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)定位檢測(cè)而被廣泛應(yīng)用。探針?lè)肿颖旧硗ǔo(wú)熒光或熒光較弱，當(dāng)與ROS反應(yīng)后，其化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。例如，二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，被酯酶水解為DCFH，DCFH被ROS氧化為具有強(qiáng)熒光的DCF，通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。類似的還有檢測(cè)超氧陰離子的DHE（二氫乙錠）探針，以及檢測(cè)*的Amplex Red探針等。

化學(xué)發(fā)光法是利用ROS與發(fā)光底物反應(yīng)產(chǎn)生的光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，如魯米諾及其衍生物在HRP和H?O?存在下會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。電子自旋共振（ESR）技術(shù)則是能直接檢測(cè)自由基的方法，通過(guò)捕捉ROS與自旋捕捉劑反應(yīng)生成的穩(wěn)定自旋加合物，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定ROS的定性和定量分析，但儀器成本較高，操作相對(duì)復(fù)雜。