D-LDH與L-LDH的區分加樣

D-乳酸脫氫酶特異性催化D-乳酸 + NAD? → 丙酮酸 + NADH。樣本中常同時存在L-LDH，需使用D-乳酸作為底物，且反應緩沖液pH調至9.0（L-LDH最適pH 7.4，D-LDH最適pH 9.0-9.5）。加樣順序：先加入緩沖液、NAD?和樣本，37℃預孵育5分鐘消除內源性NADH，再加入D-乳酸啟動反應。不加D-乳酸的對照管用于扣除內源性NADH背景。每批實驗使用純化的D-LDH標準品（來自乳酸桿菌）做陽性對照。

微量樣本的微板操作

96孔板每孔加入50μL樣本（細胞裂解液或血清）、150μL反應混合液（含100mM甘氨酸-NaOH pH 9.0，5mM NAD?，10mM D-乳酸）。使用透明平底板，加蓋防止蒸發。酶標儀預熱至37℃，動力學模式每30秒讀取340nm一次，連續10分鐘。取前5分鐘線性區間計算ΔA/min。線性區間判定：連續5個時間點的R2>0.995。復孔間ΔA/min的CV應小于8%。對于活性極低樣本（ΔA<0.002/min），改用熒光法（NADH生成量用340nm激發/460nm發射檢測）。

血清樣本的前處理

血清中D-LDH活性極低（<1 U/L），但存在內源性NADH氧化酶干擾。處理方案：血清與等量10%聚乙二醇6000混合，4℃靜置10分鐘，10000g離心10分鐘去除脂蛋白和部分干擾酶。上清液用脫鹽柱（G-25）去除小分子NAD?類似物。若仍檢測到空白管（不加D-乳酸）有ΔA，說明NADH氧化酶殘留，加入1mM-疊-氮-化-鈉-抑制。注意-疊-氮-化-鈉-會抑制后續偶聯酶反應，僅適用于直接340nm法。

組織勻漿中的活性測定

組織（如肝臟、腎）勻漿后10000g離心15分鐘，取上清。D-LDH主要存在于細胞質，但線粒體碎片會導致背景高。建議勻漿后600g離心5分鐘去除細胞核，再12000g離心20分鐘得到線粒體沉淀和胞質上清。測定胞質上清即可。組織樣本中D-LDH活性受飼料成分影響（某些益生菌含D-LDH），禁食12小時后取樣可降低變異。勻漿緩沖液加入1mM DTT保護酶活性，但DTT在340nm有吸收，測定前需用脫鹽柱去除。

結果計算與單位換算

活性單位（U）= 每分鐘消耗1μmol NAD?所需的酶量。計算公式：U/mL = (ΔA/min × 總體積ml × 稀釋倍數) / (6.22 × 光徑cm × 樣本體積ml)。6.22為NADH在340nm的毫摩爾消光系數。若使用微孔板，光徑需校正（通常0.5-0.6cm，取決于孔內液面高度）。推薦使用標準曲線法：將已知活性的D-LDH標準品稀釋成0.1-5 U/mL，測定ΔA/min繪制曲線，樣本活性從曲線讀出。標準品活性需用紫外法標定（標定條件：37℃，pH 9.0，10mM D-乳酸，2.5mM NAD?）。