PDH復合體將丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，連接糖酵解與三羧酸循環。測定其活性需要維持復合體的結構完整性，同時避免內源性磷酸化失活。

一、樣品制備的低溫操作規范

PDH復合體由E1（丙酮酸脫羧酶）、E2（二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶）和E3（二氫硫辛酰胺脫氫酶）三個亞基組成，總分子量約9.5 MDa。該復合體對溫度敏感，4℃以上時E1亞基的硫胺素焦磷酸（TPP）結合能力每小時下降15%。

組織勻漿：

取50-100 mg新鮮組織（避免凍存，凍融一次活性損失40%），加入1 mL預冷勻漿緩沖液（50 mM K?HPO?/KH?PO? pH7.0, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM苯-甲-基-磺-酰-氟-）。使用玻璃勻漿器手工勻漿（20次），冰上操作。不可使用超聲破碎，超聲產生的空化效應會解離PDH復合體。

細胞樣本：

貼壁細胞用PBS洗滌后，加入200 μL勻漿緩沖液，細胞刮刀收集，冰上裂解10分鐘。懸浮細胞以300×g離心5分鐘，沉淀重懸于勻漿緩沖液。

去磷酸化預處理：

PDH活性受磷酸化調節（PDK激酶磷酸化E1亞基使其失活）。測定總活性前，需加入λ-磷酸酶（0.5 U/μg蛋白）和2 mM MnCl?，30℃孵育15分鐘，再加入20 mM NaF終止磷酸酶活性。若只測定去磷酸化狀態活性（反映體內真實活性），則省略此步驟。

二、反應混合液配制與穩定性

標準反應體系（500 μL總反應體積）：

按順序加入除丙酮酸鈉外的所有組分，37℃預熱5分鐘。加入20-50 μL樣品（含10-50 μg蛋白），再加入丙酮酸鈉啟動反應?？瞻讓φ詹患颖徕c，或用丙酮酸替代為等體積水。

三、反應進程監測與終止

連續監測法：

PDH復合體將NAD?還原為NADH，在340 nm處吸光度上升。摩爾消光系數ε??? = 6.22 mM?1cm?1。使用石英比色皿（光徑1 cm），37℃恒溫。每30秒記錄一次吸光度，持續5分鐘。計算線性區（通常前2分鐘）的ΔA???/min。

活性計算公式：

活性（nmol/min/mg蛋白）= (ΔA???/min × 反應總體積(μL)) / (ε × 光徑(cm) × 蛋白量(mg) × 1000)

示例：ΔA=0.05/min，總體積500μL，蛋白0.05mg，ε=6.22 → 活性 = (0.05×500)/(6.22×1×0.05×1000) = 0.080 nmol/min/mg？計算有誤，實際應為ΔA×總體積/(ε×蛋白mg) × 10^3? 正確公式：活性(nmol/min/mg) = (ΔA/min × 反應體積(mL) × 10^6) / (ε × 光徑 × 蛋白(mg))。ε單位為M?1cm?1 = L·mol?1cm?1。所以ΔA=0.05，體積0.5mL，蛋白0.05mg，ε=6220 → (0.05×0.5×10^6)/(6220×1×0.05) = (25000)/(311) ≈ 80.4 nmol/min/mg。此值典型。

終點法（用于缺乏連續監測設備的實驗室）：

反應進行10分鐘后，加入50 μL 10%三-氯-乙-酸-終止。冰上放置5分鐘，10,000×g離心5分鐘。取上清測定NADH含量（340 nm吸光度）。同時制備NADH標準曲線（0-50 nmol/管）。

四、樣品中內源性干擾物的排除

乳酸脫氫酶（LDH）干擾：

LDH催化丙酮酸還原為乳酸，消耗NADH，導致PDH測定中NADH生成速率被低估。解決方法：在反應體系中加入草氨酸（10 mM），選擇性抑制LDH（抑制率>95%而對PDH無影響）。或預先用抗LDH抗體免疫沉淀去除。

NADH氧化酶干擾：

線粒體碎片中含有NADH氧化酶，將NADH重新氧化。在勻漿緩沖液中加入1 mM KCN（抑制細胞色素c氧化酶）或0.1 mM魚藤酮（抑制復合體I），可阻斷氧化酶活性。但KCN對后續部分實驗有毒性，推薦使用魚藤酮。

丙酮酸污染：

某些樣品（如糖酵解活躍的腫瘤細胞）內源性丙酮酸濃度可達100 μM。設置不加外源丙酮酸的空白作為基線活性，從總活性中扣除。

五、活性單位的定義與參考范圍

一個活性單位（U）定義為在37℃、pH7.0條件下，每分鐘催化生成1 μmol NADH的酶量。

哺乳動物組織參考活性（總活性，經磷酸酶處理后）：

• 大鼠心臟：0.5-0.8 U/mg蛋白

• 大鼠肝臟：0.1-0.2 U/mg蛋白

• 大鼠腦：0.3-0.5 U/mg蛋白

• HEK293細胞：0.05-0.1 U/mg蛋白

若測得值低于實驗室正常范圍的60%，檢查丙酮酸鈉的有效性（丙酮酸溶液在4℃一周降解約30%，應每次新鮮配制并調節pH至7.0）。

六、常見錯誤與糾正

錯誤一：使用含有Triton X-100濃度超過0.5%的勻漿緩沖液。高濃度去垢劑解離PDH復合體的E3亞基，導致活性測定值偏低。應控制Triton X-100在0.1%以內。

錯誤二：未添加輔酶A或輔酶A被氧化。輔酶A的游離巰基氧化成二硫鍵后失去活性?？墒褂肊llman試劑（DTNB）測定輔酶A的巰基含量，412 nm吸光度應>0.8（對于10 mM儲存液）。也可還原失效輔酶A：加入10 mM DTT，室溫孵育30分鐘。

錯誤三：樣品反復凍融。PDH復合體在-80℃凍融一次活性下降20%，凍融三次下降60%。建議將樣品分裝成單次用量，直接解凍后使用，不可再次冷凍。