核心檢測原理

磷脂酰絲氨酸外翻與凋亡識別

細胞凋亡是基因調控的程序性死亡過程，早期階段伴隨細胞膜不對稱性的喪失。正常活細胞的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）嚴格分布于細胞膜內側胞質面；當細胞進入凋亡程序，PS通過特定的翻轉酶機制轉移至細胞膜外側，成為可被檢測的"凋亡信號" 。

Annexin V 是一種分子量約35-36 kDa的鈣依賴性磷脂結合蛋白，對帶負電荷的PS具有高度親和力。在Ca2?存在條件下，Annexin V與外翻的PS形成穩定復合物，從而標記早期凋亡細胞 。

雙熒光通道區分細胞狀態

Annexin V-AbFluor™ 405 細胞凋亡檢測試劑盒采用藍色/紅色雙熒光標記系統：

• Annexin V-AbFluor™ 405：激發波長404 nm，發射波長431 nm，藍色熒光標記外翻PS，識別早期凋亡細胞

• 碘化丙啶（PI）：激發波長535 nm，發射波長617 nm，紅色熒光標記DNA，識別膜完整性喪失的晚期凋亡或壞死細胞

通過流式細胞術或熒光顯微鏡分析，可在單一樣本中同時區分三種細胞群：

AbFluor™ 405 染料的光譜優勢

藍色熒光通道的兼容性

AbFluor™ 405 染料在404 nm激發、431 nm發射的藍色光譜范圍內工作，與Alexa Fluor® 405、Cascade Blue®、DyLight™ 405等染料光譜特性相近 。該光譜區域具有以下實驗優勢：

• 多色實驗兼容：藍色熒光可與FITC（綠色）、PE（橙色）、APC（紅色）等染料組合，實現多參數流式分析

• 低自發熒光背景：細胞自發熒光在藍色波段較弱，信噪比相對較高

• 紫激光激發：適用于配備405 nm紫激光的流式細胞儀，如BD FACSCanto、Cytek Aurora等機型

熒光強度與光穩定性

AbFluor™ 405 染料經過優化，熒光強度和光穩定性與同類染料相當或更優 。在常規實驗光照條件下，15-30分鐘的染色孵育過程中熒光信號衰減可控，滿足流式細胞術和熒光顯微鏡的檢測需求。

標準操作流程

流式細胞術分析步驟

樣本準備階段

貼壁細胞需先用胰酶消化，消化時間控制在2-3分鐘以內。過長的胰酶處理會破壞細胞膜結構，導致PS非特異性暴露，產生假陽性信號 。消化后使用培養基終止反應，300 g離心5分鐘收集細胞。懸浮細胞直接離心收集，用冰預冷的PBS洗滌兩次。

染色孵育階段

將細胞重懸于100 μL 1× Annexin V Binding Buffer（含Ca2?），加入4-5 μL Annexin V-AbFluor™ 405和1-2 μL PI，輕柔混勻。室溫避光孵育15分鐘。Binding Buffer中的Ca2?是Annexin V與PS結合的必要輔因子，不可使用不含Ca2?的PBS替代 。

上機檢測階段

孵育結束后加入400 μL 1× Binding Buffer稀釋，置于冰上。染色后30分鐘內完成流式細胞儀檢測。使用404 nm和535 nm激光激發，在431 nm和617 nm附近收集熒光信號 。

熒光顯微鏡分析要點

貼壁細胞可直接在爬片或腔室載玻片上染色。除去培養基后用PBS洗滌兩次，加入工作液（每100 μL Binding Buffer含4-5 μL Annexin V-AbFluor™ 405和1-2 μL PI），室溫避光孵育15-30分鐘。注意此步驟不可使用PBS洗滌，必須使用Binding Buffer維持Ca2?濃度 。

染色后用Binding Buffer洗滌兩次，滴加抗熒光淬滅封片劑，使用DAPI濾光片組（激發405 nm，發射420-470 nm）觀察藍色熒光，TRITC濾光片組觀察紅色熒光。

關鍵注意事項與常見問題

貼壁細胞消化后的恢復

胰酶消化會暫時破壞細胞膜完整性，使Annexin V能夠結合到細胞膜胞質面的PS，導致假陽性染色。消化后的細胞需在培養基中恢復30分鐘，期間輕輕晃動防止重新貼壁，待膜結構恢復后再進行染色 。對于HeLa、NIH 3T3等貼壁較松的細胞系，可考慮使用無酶解離液（如Cell Dissociation Buffer）替代胰酶。

鈣離子依賴性結合

Annexin V與PS的結合嚴格依賴Ca2?。實驗全程必須使用配套的Binding Buffer，不可用普通PBS或生理鹽水替代。Binding Buffer稀釋后需現配現用，長期存放可能導致Ca2?沉淀或pH變化 。

染色后不可固定

Annexin V染色需在活細胞狀態下檢測。如需固定，應使用含Ca2?和Mg2?的PBS配制的3.7%甲醛，固定后信號可部分保留。但透化處理會破壞膜結構，導致Annexin V信號丟失，因此該染色方法不可與胞內抗體標記聯用 。

對照設置與補償調節

流式細胞術檢測時必須設置以下對照：

• 未染色對照：調節FSC/SSC電壓，確定細胞群位置

• Annexin V單染對照：調節藍色熒光通道電壓，排除PI信號溢出

• PI單染對照：調節紅色熒光通道電壓，排除AbFluor™ 405信號溢出

• 雙染樣本：使用對照優化參數后采集數據

熒光補償不當會導致假陽性或細胞群重疊。FITC-only對照細胞不應出現在PI陽性象限，反之亦然 。

假陽性排查

對照組出現高比例Annexin V陽性時，需排查以下因素：

• 細胞過度匯合或營養缺乏導致自發凋亡

• 胰酶消化過度或機械刮取造成膜損傷

• 藥物或培養基成分產生自發熒光干擾

• 染色后延遲上機，凋亡進程繼續發展

• 試劑盒過期或儲存不當（應4℃避光保存，避免凍融）

技術參數與儲存條件

應用場景

該試劑盒適用于藥物篩選與毒理學評估、腫瘤學研究中化療敏感性分析、免疫細胞活化與死亡狀態評估、干細胞培養條件優化等領域。通過藍色/紅色雙通道檢測，可在多色流式實驗中與FITC、PE、APC等標記組合，實現細胞凋亡與表面標志物或胞內因子的同步分析 。