Annexin V 與碘化丙啶（PI）聯(lián)合使用是區(qū)分凋亡早晚期及壞死細胞的經(jīng)典方法。理解其背后的分子機制才能正確解讀流式結果。

磷脂酰絲氨酸外翻：凋亡的早期標志

活細胞膜脂質(zhì)雙層呈不對稱分布。磷脂酰絲氨酸（PS）正常時僅存在于細胞膜的內(nèi)側小葉，由爬行酶和磷脂轉運酶維持。凋亡信號啟動后，胱天蛋白酶激活 scramblase 酶，同時抑制 flippase 活性。PS 在 1-3 小時內(nèi)快速外翻到細胞膜外側。Annexin V 是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，對 PS 的親和力處于納摩爾級別。在鈣離子存在下，Annexin V 與暴露的 PS 結合，每個 PS 分子可結合多個 Annexin V 形成晶格狀結構。

FITC 熒光標記的作用

FITC（異硫氰酸熒光素）通過共價鍵連接到 Annexin V 的賴氨酸殘基上。FITC 的激發(fā)峰位于 494nm，發(fā)射峰位于 518nm，對應流式細胞儀的 BL1 通道（525nm 帶通濾光片）。每個 Annexin V 分子上標記 2-4 個 FITC 分子，保證熒光亮度而不影響蛋白結合活性。FITC 對 pH 敏感，在染色緩沖液 pH 低于 6.0 時熒光強度下降 50% 以上。鈣離子濃度低于 0.5mM 時，Annexin V 無法發(fā)生構象變化，結合能力喪失。因此凋亡檢測緩沖液必須含有 2-3mM 氯化鈣。

碘化丙啶的膜不透性

PI 是一種核酸染料，分子量 668.4 Da。完整的活細胞膜和早期凋亡細胞膜排斥 PI。細胞膜結構損傷后，PI 進入細胞核，嵌入 DNA 雙鏈的堿基對之間。PI 的激發(fā)峰 536nm，發(fā)射峰 617nm，進入 PE 通道（585/42nm）或 PerCP 通道。PI 不能穿過早期凋亡細胞的完整膜，因此與 Annexin V-FITC 聯(lián)用時，流式散點圖出現(xiàn)四個象限：

• 左下：FITC 陰性、PI 陰性，代表活細胞。

• 右下：FITC 陽性、PI 陰性，代表早期凋亡細胞。

• 右上：雙陽性，代表晚期凋亡或壞死細胞。

• 左上：FITC 陰性、PI 陽性，極少出現(xiàn)，通常為機械損傷的裸核。

補償調(diào)節(jié)的必要性

FITC 的發(fā)射光譜在 520nm 處有主峰，但在 570nm 處仍有約 20% 的溢出信號進入 PE 通道。PI 的發(fā)射光譜在 617nm 處，對 FITC 通道幾乎沒有溢出。流式細胞術需要設置 FITC 單染管（僅 Annexin V-FITC 染色的凋亡細胞）和 PI 單染管。調(diào)節(jié) FITC 通道對 PE 通道的補償，計算公式為 spillover = (PE 通道中 FITC 單染細胞的平均熒光強度) / (FITC 通道中同一群細胞的平均熒光強度)。補償過量會壓扁陽性群，補償不足則出現(xiàn)斜向拖尾。

鈣離子依賴的雙重驗證

實際操作中容易忽略鈣離子的作用。部分研究者使用 PBS 稀釋 Annexin V，導致鈣離子缺失。此時 Annexin V 與 PS 的結合屬于非特異性靜電吸附，背景升高且早期凋亡信號消失。驗證鈣離子是否足量的簡單方法：取一份熱休克誘導的凋亡細胞樣本，分別用含鈣和不含鈣的緩沖液染色。不含鈣樣本的 FITC 熒光強度應低于含鈣樣本的 10% 以下。