樣品準(zhǔn)備的離心條件

貼壁細(xì)胞在藥物處理結(jié)束后，輕輕吸取上清液。吸頭從孔邊緣緩慢插入，不要刮到細(xì)胞層。收集到的上清液立即以300×g離心5分鐘，溫度控制在4℃。這個(gè)離心力剛好能沉淀懸浮的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，同時(shí)不會(huì)壓破活細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣使用更高離心力（如800×g），多出的力會(huì)使培養(yǎng)上清中原本完好的細(xì)胞破裂，釋放出LDH，導(dǎo)致背景值升高0.2至0.3 OD單位。懸浮細(xì)胞的處理更直接：將細(xì)胞懸液整體轉(zhuǎn)移到離心管，同樣300×g離心5分鐘，取上清。離心后的上清如果不馬上檢測(cè)，可以在2至8℃存放3天，但LDH活性每天下降約5%至10%。長(zhǎng)期保存需要-20℃冷凍，解凍后可能出現(xiàn)蛋白沉淀，需要再次離心。

反應(yīng)液的配制次序

商業(yè)化的LDH檢測(cè)試劑盒通常提供三瓶干粉：底物混合物（含乳酸鋰和NAD+）、INT顯色劑、反應(yīng)緩沖液。配制時(shí)按以下順序操作：先取反應(yīng)緩沖液，加入底物混合物粉末，渦旋溶解；接著加入INT溶液混勻；整瓶反應(yīng)液在37℃預(yù)熱5分鐘后再使用。關(guān)鍵的錯(cuò)誤順序：將NAD+與INT同時(shí)加入會(huì)導(dǎo)致INT在中性pH下緩慢氧化，試劑變成淡粉色。另外注意，NAD+在溶液中極其不穩(wěn)定，配制好的反應(yīng)液必須在30分鐘內(nèi)用完。若實(shí)驗(yàn)室自己配制反應(yīng)液，建議將NAD+單獨(dú)分裝為小管，臨用前每管新鮮溶解并添加。

孵育溫度與時(shí)間控制

加入反應(yīng)液后，37℃避光孵育。20至30分鐘是標(biāo)準(zhǔn)窗口。以HeLa細(xì)胞為例，用1% Triton X-100作為陽(yáng)性對(duì)照，20分鐘時(shí)OD490達(dá)到1.8，30分鐘時(shí)達(dá)到2.2，超過(guò)40分鐘則信號(hào)停滯或略微下降。低毒性樣本（細(xì)胞釋放率低于10%）需要延長(zhǎng)到40分鐘才能獲得明顯信號(hào)。判斷最佳時(shí)間的簡(jiǎn)易方法：在孵育過(guò)程中每10分鐘讀取一次，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔的OD值接近酶標(biāo)儀上限（如2.5）時(shí)立即終止所有孔。孵育期間每10分鐘將板子從培養(yǎng)箱取出，輕拍四周邊緣使沉淀重懸，否則甲臜結(jié)晶會(huì)聚集在孔底中央，讀數(shù)偏差可達(dá)±0.15。

終止反應(yīng)的操作細(xì)節(jié)

終止反應(yīng)使用0.5M醋酸或1M檸檬酸，每孔加入50μl。終止液應(yīng)將反應(yīng)體系的pH降至4.0以下，此時(shí)乳酸脫氫酶變性失活。加終止液時(shí)，將移液器吸頭靠在孔壁上方，讓液體沿壁流下，避免直接沖擊孔底產(chǎn)生氣泡。一旦產(chǎn)生氣泡，用針頭或干凈的槍頭挑破。終止后混勻3至5秒，可用多通道移液器反復(fù)吸打兩次。在30分鐘內(nèi)完成490nm讀值。超過(guò)2小時(shí)后，甲臜產(chǎn)物會(huì)吸附到聚苯乙烯板底面，形成肉眼可見(jiàn)的紅色斑點(diǎn)，此時(shí)OD值比真實(shí)值高出0.1至0.3，且無(wú)法通過(guò)搖晃復(fù)原。

背景扣除與對(duì)照設(shè)置

每個(gè)實(shí)驗(yàn)板必須包括以下對(duì)照，每種至少三個(gè)復(fù)孔：

• 培養(yǎng)基背景孔：僅有培養(yǎng)基和反應(yīng)液，無(wú)細(xì)胞。

• 樣品自發(fā)釋放孔：未處理的對(duì)照組細(xì)胞上清。

• 細(xì)胞最大釋放孔：加入終濃度1% Triton X-100處理45分鐘后的上清。

• 體積校正對(duì)照（可選）：加入等體積PBS代替反應(yīng)液，用于檢測(cè)樣品本身的顏色。

計(jì)算公式：（實(shí)驗(yàn)組OD - 培養(yǎng)基背景 - 樣品自發(fā)釋放OD + 培養(yǎng)基背景）÷（最大釋放組OD - 培養(yǎng)基背景）×100%。注意，自發(fā)釋放孔已經(jīng)包含培養(yǎng)基背景，但為了計(jì)算準(zhǔn)確，通常簡(jiǎn)化公式為：（實(shí)驗(yàn)組OD - 自發(fā)釋放孔OD）÷（最大釋放孔OD - 自發(fā)釋放孔OD）×100%。如果使用公式時(shí)忽略了培養(yǎng)基背景，細(xì)胞毒性結(jié)果可能被低估2%至5%。

操作中的污染風(fēng)險(xiǎn)

血清中的乳酸脫氫酶含量約為200至400 U/L，活性較高。操作時(shí)槍頭接觸到試管外壁后再插入試劑瓶，或者使用非無(wú)菌的加樣槽，都可能把痕量血清帶入試劑中。建議采取三個(gè)預(yù)防措施：一是將試劑分裝為每次實(shí)驗(yàn)的用量；二是使用帶濾芯的槍頭；三是單獨(dú)準(zhǔn)備一套專門用于LDH檢測(cè)的移液器。96孔板的外圍孔容易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，這些孔的細(xì)胞代謝異常，LDH釋放率比中間孔高5%至10%。對(duì)策是只使用板子中間的60個(gè)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，外圍孔加入200μl無(wú)菌PBS不用于檢測(cè)。

常見(jiàn)異常結(jié)果排查

如果陽(yáng)性對(duì)照孔的OD值低于0.8，檢查以下幾點(diǎn)：裂解液是否真正有效（Triton X-100需要新鮮配制，儲(chǔ)存超過(guò)6個(gè)月的舊液可能氧化失效）；孵育溫度是否準(zhǔn)確（培養(yǎng)箱門頻繁開(kāi)關(guān)導(dǎo)致低于37℃）；反應(yīng)液是否在配制后放置過(guò)久。如果所有孔的OD值都偏高（空白培養(yǎng)基孔>0.3），說(shuō)明反應(yīng)液或培養(yǎng)基被還原性物質(zhì)污染，或者裂解液中的Triton X-100被帶入到未裂解孔中。如果重復(fù)孔之間CV值大于15%，常見(jiàn)原因是加樣前沒(méi)有充分混勻上清，或者板子孵育時(shí)未加蓋導(dǎo)致邊緣孔蒸發(fā)濃縮。