培養(yǎng)基中EdU的摻入條件

EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）替代BrdU摻入DNA合成期。貼壁細胞在正常培養(yǎng)基中加入EdU，終濃度10μM。處理時間根據細胞增殖速度設定：HeLa細胞2小時，原代成纖維細胞需12-18小時。超過24小時可能導致EdU摻入過多，背景增高。EdU工作液需新鮮配制，4℃存放超過一周會降解，表現為標記陽性率下降50%以上。

固定與通透的步驟順序

先固定后通透。4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，固定液需新鮮配制（儲存超過一個月的多聚甲醛聚合，固定效果下降）。PBS洗滌3次，每次5分鐘。通透使用0.5% Triton X-100，室溫處理20分鐘。注意：若先通透再固定，EdU標記的DNA片段會從核內擴散，出現胞漿陽性信號。對于細胞核輪廓模糊的樣本，通透后增加一步0.1M甘氨酸封閉醛基，減少背景。

點擊反應的試劑配制

點擊反應（Click reaction）的組分：CuSO?（2mM）、TCEP（2mM）、含疊氮基團的熒光染料（5μM）、TBTA（0.1mM）作為銅離子穩(wěn)定劑。配制順序：先混合TBTA與TCEP，再加入CuSO?和熒光染料。TBTA在DMSO中配成10mM儲存液，-20℃可保存6個月。反應液需在30分鐘內使用，因為銅離子會催化熒光的非特異性氧化。每孔加入100μl反應液，室溫避光孵育30分鐘。

核復染與封片的選擇

復染使用Hoechst 33342或DAPI。Hoechst 33342在活細胞中通透性好，固定后同樣適用。終濃度1μg/ml，室溫孵育10分鐘。DAPI需要高濃度（2μg/ml）且孵育時間延長至15分鐘。封片時使用抗熒光淬滅劑，含甘油和PVA的基質。避免使用含Tris的封片劑，因為Tris會與銅離子殘留形成沉淀，產生顆粒狀背景。封片后4℃避光存放，一周內完成成像。

圖像采集的參數調整

寬場熒光顯微鏡設置：使用DAPI通道（激發(fā)360-400nm，發(fā)射420-470nm）拍攝細胞核；FITC通道（激發(fā)470-495nm，發(fā)射515-545nm）拍攝EdU標記。共聚焦顯微鏡：激光功率設置DAPI 5%，FITC 8%。曝光時間以核熒光強度接近飽和但不溢出為準。EdU陽性細胞的判定閾值：熒光強度是背景的3倍以上。每孔至少拍攝5個視野，每個視野計數200個細胞。注意用DAPI核信號確認細胞總數，避免因EdU標記不均導致計數偏差。

常見現象的處理

背景中出現非核點狀熒光，原因是CuSO?與熒光染料形成沉淀。過濾反應液（0.22μm濾膜）可以消除。標記陽性率低于預期，檢查EdU是否失效（EdU儲存液-20℃可保存6個月，反復凍融3次后失效），或者延長EdU處理時間。陽性率過高（超過80%且對照組也高），檢查是否誤加了EdU至所有孔，或者固定前洗滌不充分導致未摻入的EdU殘留。用含0.1% Tween-20的PBS洗滌3次可降低背景。