基質膠的濃度與厚度要求

侵襲實驗在Transwell膜上預鋪Matrigel（基底膜基質膠）。Matrigel的工作濃度推薦200-300μg/ml（即1:6至1:4稀釋）。濃度低于100μg/ml時，凝膠孔隙過大，細胞不需分泌基質金屬蛋白酶即可穿過，假陰性率升高。濃度高于500μg/ml時，凝膠過密，即使高侵襲性細胞也無法穿過。鋪膠體積：24孔板配套小室，每孔加入50-70μl稀釋膠，鋪滿膜面。膠層厚度應控制在50-100μm，過厚導致孵育時間延長至48小時以上，細胞活力下降。

凝膠聚合的溫度與時間控制

Matrigel在10℃以上開始聚合，22℃-37℃形成牢固凝膠。操作時所有槍頭、小室、稀釋液需預冷至4℃。稀釋用無血清培養基（不含酚紅）或PBS。鋪膠后輕輕敲擊小室排除氣泡，立即放入37℃培養箱孵育30-60分鐘。聚合時間少于20分鐘時膠未凝固，細胞上樣后會沉入膠內；超過2小時凝膠脫水收縮，表面形成硬殼。聚合后的凝膠層呈現無色透明狀，若出現白色絮狀沉淀提示溫度波動導致提前聚合。

細胞上樣與侵襲時間的匹配

上室接種密度：5×10?至1×10?個細胞/孔（24孔板）。密度過高（>2×10?）導致細胞在膠面上形成多層堆積，下層細胞缺氧死亡。侵襲時間：高侵襲細胞（如MDA-MB-231）需16-20小時，低侵襲細胞（如MCF-7）需36-48小時。時間過長（>72小時）時，Matrigel被細胞分泌的蛋白酶逐漸降解，失去屏障作用。預實驗中每6小時取一個小室染色，繪制侵襲曲線，選擇線性增長中段的時間點進行正式實驗。

染色方法的選擇與定量參數

侵襲到膜下表面的細胞常用結晶紫染色（0.5%，30分鐘）或吉姆薩染色（10%濃度，15分鐘）。結晶紫染色后，用棉簽擦去上表面膠及細胞，膜在風干后拍攝。定量方法一：顯微鏡下每膜隨機取5個200×視野計數。變異系數應低于15%。方法二：將膜剪下，放入含100μl 10%乙酸的孔板中振蕩10分鐘洗脫結晶紫，轉移至96孔板測OD590。此法快速但無法區分細胞是穿過膜還是粘附在膜邊緣。熒光染色（如CellTracker Green，5μM預染細胞）可活細胞追蹤，侵襲后的細胞直接用熒光酶標儀讀數（激發485/發射535），但需黑色不透明板以減少孔間干擾。

陽性與陰性對照的設置

陽性對照：使用高侵襲性細胞系（HT1080纖維肉瘤或MDA-MB-231）和趨化劑（10% FBS）。陰性對照：無Matrigel包被的膜，細胞應全部穿過；或加入基質金屬蛋白酶抑制劑（GM6001，25μM），侵襲率應降低70%以上。空白對照：上室加無細胞培養基，檢測下室有無污染。每組至少3個復孔。計算侵襲指數：（實驗組穿過細胞數）/（陰性對照穿過細胞數）。陰性對照為無膠組時，侵襲指數低于0.2表明膠層有效。

Matrigel批間差異的控制

Matrigel來自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤，不同批次的蛋白濃度和凝膠強度存在差異。批次間變化：基質金屬蛋白酶含量、層粘連蛋白/膠原IV比例波動±20%。使用前進行批次驗證：稀釋至200μg/ml，鋪膠，用同一細胞系測試侵襲率，設置固定批次為參照。侵襲率波動超過±15%的批次不建議用于縱向比較研究。儲存方法：原液-20℃分裝，避免反復凍融。解凍時4℃緩慢過夜，不可37℃速融。已稀釋的Matrigel不可再凍存，4℃存放不超過48小時。