樣本制備與裂解

Caspase 3/7在細胞凋亡執行階段發揮核心剪切功能，其活性檢測對樣本新鮮度要求苛刻。收集細胞時，貼壁細胞采用胰酶消化需控制消化時間，過度消化會誘導機械應激相關的凋亡，造成基線信號偏高。消化液中加入血清終止后，預冷PBS洗滌兩次，去除培養基中的蛋白酶與血清成分。懸浮細胞直接離心收集，離心轉速控制在300×g，過高轉速導致細胞機械破裂，胞內蛋白酶釋放干擾后續測定。

裂解緩沖液的選擇直接影響酶活性保留。采用供應商提供的專用裂解液，其中含有的非離子型去垢劑濃度通常在0.5%-1%，足以破碎細胞膜而不破壞酶活性中心。裂解過程在冰浴中進行，時間控制在15-20分鐘，期間每5分鐘輕彈管壁促進裂解均勻。組織樣本需先以眼科剪剪成1 mm3碎塊，加入裂解液后以玻璃勻漿器手動研磨10-15次，避免電動勻漿產熱導致酶失活。裂解產物在4℃、12,000×g離心15分鐘，上清即為待測樣本。

蛋白定量與濃度均一化

各樣本蛋白濃度的差異會直接導致活性讀數偏離真實值。采用BCA法進行蛋白定量，標準品梯度稀釋覆蓋0.125-2 mg/mL范圍，確保待測樣本落在標準曲線中段。測定裂解液上清的蛋白濃度后，以裂解緩沖液將所有樣本稀釋至統一濃度，通常設定為1-3 mg/mL。濃度過低的樣本信號接近檢測下限，讀數波動大；濃度過高則內源性抑制劑與底物消耗過快，偏離線性動力學范圍。

反應體系配置

在96孔黑板或透明板中，每孔加入50 μL蛋白樣本與50 μL 2×反應緩沖液。反應緩沖液中DTT的終濃度維持在10 mM，保障Caspase活性中心Cys殘基的還原狀態。加入熒光底物（如Ac-DEVD-AMC或Z-DEVD-AFC）至終濃度200 μM，該濃度處于底物飽和區，確保酶促反應處于零級動力學階段。設立空白對照（裂解液+緩沖液+底物）、陰性對照（未處理細胞裂解液）與陽性對照（重組Caspase 3或凋亡誘導劑處理樣本）。加樣時吸頭貼近液面，避免氣泡產生，氣泡會造成熒光散射。

孵育條件控制

酶標板置入37℃恒溫孵育箱或酶標儀內置孵育模塊。Caspase 3/7在37℃下的催化效率約為25℃的2-3倍，溫度波動控制在±0.5℃以內。孵育時間依據樣本預期活性設定，常規為1-2小時。信號過強時縮短至30分鐘，信號偏弱可延長至4小時。孵育期間保持板蓋密閉，防止邊緣孔因蒸發導致體積變化與濃度升高。

讀數與數據分析

熒光法在380/460 nm（激發/發射）讀取AMC信號，或在400/505 nm讀取AFC信號。比色法在405 nm讀取pNA釋放量。讀數前扣除空白孔均值，獲取凈信號值。以標準品濃度為橫坐標、信號值為縱坐標擬合標準曲線，計算各樣本的底物轉化速率（pmol/min）。活性單位通常以相對熒光單位（RFU）或pmol AMC/min/mg protein表示。繪制柱狀圖時標注誤差棒，展示復孔標準差。

質控與復測策略

陽性對照信號應落在標準曲線中段，偏離提示試劑失活或操作失誤。復孔CV超過15%時，排查加樣準確性，更換校準后的移液器。樣本信號處于檢測限邊緣時，增加蛋白上樣量或延長孵育時間后復測。不同批次試劑盒不可混用，避免緩沖液配方差異引入系統誤差。原始數據與標準曲線截圖存檔，便于后續審計追蹤。