樣本采集與抗凝處理

血清樣本采用促凝管或黃色頭蓋真空采血管采集，室溫靜置30分鐘后4℃、3000 rpm離心10分鐘。血漿樣本選用肝素鋰、EDTA-K2或草酸鹽抗凝，避免使用溶血樣本，紅細胞內葡萄糖濃度約為血漿的70%，溶血導致結果假性偏低。樣本采集后2小時內完成檢測，或分離血清/血漿后4℃保存24小時，長期保存需-20℃凍存，避免反復凍融引起糖酵解消耗。

試劑復溶與標準品配制

GOD-POD試劑通常為液體雙試劑或凍干粉。凍干粉以指定體積蒸餾水復溶，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩產生氣泡。復溶后試劑室溫放置15分鐘，使各組分充分溶解平衡。標準品采用葡萄糖標準液（通常5.55 mmol/L或100 mg/dL）或系列濃度梯度（0、2.78、5.55、11.1、16.65 mmol/L）。標準品與樣本采用相同基質（如含蛋白的模擬血清），減少基質效應。

反應體系搭建與加樣順序

在96孔透明板或比色管中，按空白孔（蒸餾水）、標準孔、樣本孔排列，每個濃度/樣本設復孔。加樣順序：先加樣本或標準品10 μL，再加工作液100-200 μL（根據試劑盒說明），輕輕震蕩混勻。加樣時吸頭貼近液面，避免氣泡。空白孔用于扣除試劑本底，標準孔用于構建曲線或計算因子。樣本量超過線性范圍時，以生理鹽水稀釋后重新測定，記錄稀釋倍數。

孵育條件與顯色控制

反應在37℃水浴或恒溫孵育箱中進行，時間10-15分鐘。溫度低于30℃導致顯色不-完-全-，結果偏低；高于40℃可能使酶失活。孵育期間避光，防止醌亞胺色素光分解。顯色反應依賴溶解氧，微孔板中液面高度影響氧擴散，反應體積不宜低于100 μL/孔。顯色時間需嚴格一致，-首-批-與末批樣本的時間差控制在5分鐘以內，或采用批量計時。

檢測讀數與計算方式

終點法在505 nm（或500-520 nm）處測定吸光度。若使用標準曲線法，以標準品濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標擬合直線，樣本濃度由回歸方程計算。若采用因子法（單點校準），計算公式：樣本濃度 =（樣本吸光度-空白吸光度）/（標準吸光度-空白吸光度）×標準濃度。脂血樣本以高速離心（10,000 rpm，10分鐘）去除乳糜層后取下層清液測定。黃疸樣本膽紅素在480-520 nm有吸收，需設置樣本自身空白（不加GOD）校正。

室內質控與異常排查

每批次檢測插入低、高兩個濃度質控品，質控結果落在允許范圍內（通常±2SD）方可發布報告。質控品失控時，排查試劑批號更換、校準品失效、波長偏移或溫度波動。試劑空白吸光度超過0.1提示試劑污染或POD活性下降，需更換試劑。標準曲線線性不佳（R2<0.98）時，重新配制標準品并檢查加樣準確性。