一、MDA——脂質過氧化的核心生物標志物

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是生物體內脂質過氧化反應的重要終產物之一。當活性氧（ROS）攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸時，會引發脂質過氧化的鏈式反應，經過起始、傳播和終止階段，最終生成多種醛類、酮類和過氧化物，其中MDA因其相對穩定性和含量豐富，被廣泛認可為評價氧化應激水平的經典生物標志物。

MDA分子式為C?H?O?，屬于小分子二醛類化合物，具有較高的反應活性。它能夠與蛋白質、核酸、磷脂及氨基化合物發生加成或交聯反應，從而對細胞結構和功能造成損傷。研究表明，MDA水平升高與多種病理狀態密切相關，包括心血管疾病、神經退行性病變、糖尿病、腫瘤以及衰老相關疾病。因此，準確測定生物樣本中的MDA含量，對于評估機體氧化損傷程度、闡明疾病發生機制以及評價抗氧化干預效果具有重要意義。

二、熒光法檢測MDA的核心原理

MDA檢測中經典的方法是TBA（thiobarbituric acid）法。其基本原理是：在酸性加熱條件下，MDA與TBA發生縮合反應，生成粉紅色的MDA-TBA加合物。該加合物具有特定的熒光特性，在特定波長激發光照射下能夠發射熒光信號，且熒光強度與MDA含量成正比。

Abbkine（亞科因）旗下CheKine™ Pro 丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（熒光法）（貨號：KTB9050）采用優化的熒光檢測技術，激發波長為535 nm，發射波長為587 nm，通過熒光酶標儀測定熒光強度，與標準曲線進行對比，即可準確計算樣本中的MDA含量。該試劑盒檢測限可達0.04 nmol/mL，檢測范圍為0.04–10 nmol/mL，適用于動物組織、植物組織、細胞、血清（漿）、尿液等多種樣本類型。

與傳統的比色法（532 nm處測定吸光度）相比，熒光法檢測靈敏度通常提升約一個數量級，能夠更有效地檢測MDA含量較低的樣本，如細胞裂解液、微量組織勻漿和低濃度血清樣本。此外，熒光法信號背景比更高，受樣本濁度和色素干擾的影響相對較小，有助于提高低含量范圍數據的可靠性。

三、CheKine™ Pro MDA熒光法檢測試劑盒操作流程

3.1 樣本制備

樣本制備是影響檢測結果準確性的關鍵步驟，全程應在低溫條件下進行，以抑制MDA的分解或額外生成。

組織樣本：取適量組織（建議20 mg），用預冷PBS（0.01 M，pH 7.4）充分清洗后，按1:9（w/v）比例加入勻漿介質，在4℃下充分勻漿。勻漿液于10,000×g、4℃離心10分鐘，收集上清液待測。組織勻漿需充分破碎，確保胞內MDA釋放。
細胞樣本：收集1×10?至1×10?個細胞，PBS洗滌后加入裂解液，冰上裂解10分鐘，離心取上清。建議在裂解液中加入抗氧化劑BHT以防止樣本處理過程中額外的脂質過氧化。
血清/血漿樣本：可直接檢測或適當稀釋后檢測。制備過程中需避免溶血，因為血紅蛋白會對測定產生干擾。如果樣本不能立即檢測，可于-80℃保存，但不宜超過一個月。
尿液樣本：取100 μL尿液，10,000×g離心5分鐘，取上清液待測。尿液MDA濃度通常較低，建議直接檢測或適當濃縮。

3.2 標準曲線制備

標準品需現配現用，避免長時間儲存導致MDA分解。建議設置不少于7個濃度梯度的標準品點，覆蓋0.04–10 nmol/mL的線性范圍，確保標準曲線相關系數R2大于0.99。標準曲線應覆蓋樣本的預期濃度范圍，避免外推計算帶來的誤差。

3.3 反應體系配制

在反應管中依次加入樣本（或標準品）與顯色工作液，充分混勻。反應體系需使用密閉管蓋，防止高溫孵育時液體揮發和壓力積聚。將反應管置于95–100℃水浴中孵育40–60分鐘，時間需精確控制——反應時間過短會導致MDA與TBA反應不充分，過長則可能增強非特異性反應。反應結束后立即將反應管置于冰浴中冷卻至少10分鐘，確保充分冷卻以終止反應。冷卻后以10,000×g離心10分鐘，去除蛋白沉淀和不溶性雜質，取上清液轉移至全黑96孔熒光板進行檢測。

3.4 熒光檢測與結果計算

使用熒光酶標儀進行檢測，激發波長設置為535 nm，發射波長設置為587 nm。檢測前酶標儀需預熱30分鐘以上，確保儀器光源穩定。每個樣本和標準品建議設置3個復孔，以減少實驗誤差。

記錄每個孔的熒光強度值（RFU），計算扣除空白后的熒光值：ΔRFU樣品 = RFU樣品 – RFU空白。以標準品MDA濃度為橫坐標、ΔRFU標準為縱坐標繪制標準曲線，根據回歸方程計算樣本MDA含量。

按蛋白濃度歸一化時，需同步測定樣本蛋白濃度（推薦使用BCA法）：

MDA含量（nmol/mg蛋白）= 樣本MDA含量（nmol/mL）× 稀釋倍數 ÷ 蛋白濃度（mg/mL）

按組織質量歸一化時：

MDA含量（nmol/g組織）= 樣本MDA含量（nmol/mL）× 稀釋倍數 × 樣本總體積（mL）÷ 組織重量（g）

四、熒光法與微量比色法的對比分析

MDA檢測中，TBA比色法因操作簡便而應用廣泛，但其在靈敏度和特異性方面存在一定局限。熒光法在以下維度展現出明顯優勢：

靈敏度：熒光法檢測限通常為0.04 nmol/mL級別，比比色法（通常為1–2 μM級別）提高約一個數量級以上。對于MDA含量較低或樣本量有限的實驗體系，熒光法能夠提供更可靠的數據。

線性范圍：CheKine™ Pro熒光法試劑盒檢測范圍為0.04–10 nmol/mL，覆蓋了從低濃度到高濃度的需求。而其比色法對應產品檢測范圍通常為1–50 μM，低濃度樣本容易落在檢測限以下。

特異性：TBA比色法檢測到的實際上是TBA反應物（TBARS），除MDA外，部分醛類、糖降解產物和其他反應性小分子也可能與TBA發生反應，導致結果偏高。雖然熒光法同樣基于TBA反應，但其更高的信號分辨能力有助于在低濃度范圍內更好地區分目標信號與背景干擾。

適用場景差異：比色法適合常規篩查和樣本量較大的批量實驗，設備要求較低，大多數實驗室的分光光度計均可完成。熒光法則需要配備熒光酶標儀，適合MDA含量較低、樣本量有限或對靈敏度要求較高的研究場景，如細胞氧化應激模型、微量組織樣本和低濃度血清樣本。

五、實驗注意事項與常見問題解析

5.1 關鍵操作注意點

全程低溫操作：樣本處理、勻漿和離心均應在4℃條件下進行，減少MDA的非特異性分解或生成。裂解液中應加入抗氧化劑BHT。
避光保護：熒光探針對光敏感，反應體系配制和檢測應使用全黑96孔板，并盡量避免長時間光照暴露。
溫度與時間控制：高溫反應時間需精確控制在40–60分鐘，溫度不足會導致反應不充分，時間過長則可能增強非特異性反應。冷卻過程應充分，建議冰浴10分鐘以上。
儀器預熱：熒光酶標儀需預熱30分鐘以上，確保激發光源穩定。激發和發射波長需準確設置，波長偏差會明顯影響熒光信號強度。
標準品管理：標準品必須現配現用，避免反復凍融和長時間儲存。建議使用精密移液器進行梯度稀釋操作。
避免交叉污染：每個樣品使用獨立的吸頭，加樣前后充分混勻反應體系。

5.2 常見問題排查

標準曲線相關系數低于0.99：檢查標準品配制是否準確，確認試劑是否出現沉淀或顏色異常，核對激發和發射波長設置是否正確。

樣本熒光值超出標準曲線范圍：樣本濃度可能偏高，需增加稀釋倍數后重新檢測。建議在正式實驗前進行預實驗，確定合適的稀釋倍數。

復孔變異系數（CV）大于10% ：可能原因為加樣不準、混勻不充分或儀器不穩定。應使用經校準的精密移液器，確保加樣后充分混勻，并檢查酶標儀工作狀態。

熒光信號異常偏低：檢查試劑是否失效，確認反應時間是否充足，核對激發和發射波長設置。TBA工作液配制后應在4℃避光保存，一周內使用。

熒光信號異常偏高：排除試劑污染可能，檢查樣本是否存在干擾物質（如血紅蛋白、膽紅素等），確認空白對照設置是否合理。

六、MDA熒光法檢測的典型應用場景

心血管疾病研究：氧化應激在動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病中扮演重要角色。MDA作為脂質過氧化的標志物，可用于評估血管內皮氧化損傷程度和抗氧化治療的干預效果。

神經退行性疾病研究：腦組織富含多不飽和脂肪酸，對氧化損傷尤為敏感。在阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病模型中，MDA水平的變化可作為神經細胞膜脂質氧化損傷的重要參考指標。

腫瘤研究：氧化應激與腫瘤的發生、發展及治療響應密切相關。MDA檢測可用于評估腫瘤微環境中的氧化應激水平，以及化療藥物對腫瘤細胞造成的氧化損傷。

植物抗逆研究：在干旱、高溫、鹽堿、病害等逆境脅迫下，植物體內ROS大量積累，導致膜脂過氧化加劇。MDA含量是評價植物抗逆性和氧化損傷程度的核心指標。

藥物與毒理評價：在抗氧化藥物篩選和化合物毒理學安全性評估中，MDA水平的檢測可用于衡量藥物對細胞氧化損傷的保護效應或毒性效應。

食品科學與油脂品質評估：MDA是反映油脂氧化變質程度的重要指標。在肉制品、食用油和含油食品的保鮮工藝研究與品質控制中，MDA檢測可幫助評價氧化程度和抗氧化添加劑的效果。

CheKine™ Pro 丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（熒光法）（貨號：KTB9050）以優化的熒光檢測體系，為科研人員提供了靈敏、便捷的MDA定量方案。其檢測限低至0.04 nmol/mL，適用于多種生物樣本類型，能夠滿足從基礎氧化應激研究到應用型毒理評價的多層次實驗需求。

丙二醛（MDA）熒光法檢測：原理、操作與脂質過氧化研究應用

一、MDA——脂質過氧化的核心生物標志物

二、熒光法檢測MDA的核心原理

三、CheKine™ Pro MDA熒光法檢測試劑盒操作流程

3.1 樣本制備

3.2 標準曲線制備

3.3 反應體系配制

3.4 熒光檢測與結果計算

四、熒光法與微量比色法的對比分析

五、實驗注意事項與常見問題解析

5.1 關鍵操作注意點

5.2 常見問題排查

六、MDA熒光法檢測的典型應用場景

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提示

丙二醛（MDA）熒光法檢測：原理、操作與脂質過氧化研究應用

一、MDA——脂質過氧化的核心生物標志物

二、熒光法檢測MDA的核心原理

三、CheKine™ Pro MDA熒光法檢測試劑盒操作流程

3.1 樣本制備

3.2 標準曲線制備

3.3 反應體系配制

3.4 熒光檢測與結果計算

四、熒光法與微量比色法的對比分析

五、實驗注意事項與常見問題解析

5.1 關鍵操作注意點

5.2 常見問題排查

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五、實驗注意事項與常見問題解析

六、MDA熒光法檢測的典型應用場景