敲重點(diǎn)！！！

基于這個(gè)原理，可以通過(guò)檢測(cè) ATP 的消耗量，ADP 生成量和磷酸化底物含量，檢測(cè)激酶活性。

激酶的三個(gè)檢測(cè)方向：活性、結(jié)合與選擇性

1.抑制活性：化合物在生化水平或細(xì)胞水平抑制激酶磷酸化功能的效力。

2.結(jié)合能力：檢測(cè)化合物與激酶結(jié)合的強(qiáng)度、速度 (結(jié)合速率) 和持續(xù)時(shí)間 (解離速率)。

3.選擇性：檢測(cè)化合物對(duì)目標(biāo)激酶及其他數(shù)百種激酶的特異性又被稱為激酶譜篩選，高選擇性是激酶藥物應(yīng)用時(shí)低毒副作用的保障。

通過(guò)使用純化的激酶蛋白，直接評(píng)估化合物對(duì)酶活性的影響。

1.放射性檢測(cè) (經(jīng)典方法)：

該方法是蛋白激酶檢測(cè)的一種經(jīng)典方法。使用放射性同位素標(biāo)記 ATP，蛋白激酶將放射性標(biāo)記的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至肽或蛋白質(zhì)底物。隨后通過(guò)分離并測(cè)量底物上摻入的放射性信號(hào)來(lái)定量激酶活性。優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、可以直接反映激酶活性；缺點(diǎn)是放射性 ATP 的半衰期較短以及存在放射性廢物處理問(wèn)題^[2]。

熒光法是現(xiàn)代高通量篩選的主力。基于能量共振轉(zhuǎn)移或化學(xué)發(fā)光等原理，通過(guò)檢測(cè)磷酸化底物產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)反應(yīng)激酶活性。由于更易操作、高靈敏度和高通量，非常適合大規(guī)模初篩，熒光方法已在很大程度上取代了傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記檢測(cè)。缺點(diǎn)是如果化合物本身有很強(qiáng)的自發(fā)熒光或者蛋白水解酶的抑制性，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。

1. 時(shí)間分辨熒光 (Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET)

由于樣品中的蛋白質(zhì)、緩沖液組分、塑料器皿等本身會(huì)產(chǎn)生微弱的短壽命熒光，傳統(tǒng)熒光檢測(cè) (如 FRET，熒光共振能量轉(zhuǎn)移) 通常會(huì)受到背景熒光的干擾。TR-FRET 使用具有長(zhǎng)熒光壽命的鑭系元素 (如銪 Eu3?、鋱 Tb3? 等) 作為供體熒光基團(tuán)，標(biāo)記在磷酸化抗體/肽段上，在激發(fā)一段時(shí)間后再對(duì)熒光數(shù)值進(jìn)行檢測(cè)，可以極大程度消除背景熒光干擾，提高信噪比。當(dāng)供體和受體 (染料，如 XL665、d2) 在足夠近的距離 (通常 1-10 nM) 內(nèi)，且供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊時(shí)，激發(fā)供體的能量會(huì)非輻射地轉(zhuǎn)移到受體上，導(dǎo)致受體發(fā)出熒光^[3]。受體熒光/供體熒光的比值與磷酸化底物的量，即激酶活性成正比。

圖 1. TR-FRET檢測(cè)原理^[3]。

2. Kinase-Glo 方法 (檢測(cè)剩余 ATP)：

Kinase-Glo 是一種均質(zhì)的非放射性的方法，激酶反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積的 Kinase-Glo 試劑，試劑中的螢光素酶會(huì)利用反應(yīng)體系中剩余的 ATP 產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而定量地檢測(cè)純化激酶的活性，信號(hào)強(qiáng)弱與激酶活性成反比^[4][5]。Kinase-Glo 法幾乎適用于任何底物為 ATP 的酶的檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單，無(wú)需洗滌，適合大規(guī)模篩選。

圖 2. Kinase-Glo檢測(cè)原理^[5]。

3. ADP-Glo 方法 (檢測(cè)生成的 ADP)：

Kinase-Glo 實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)加入 ADP-Glo 試劑終止激酶反應(yīng)，并耗盡剩余的所有 ATP。此時(shí)體系中沒(méi)有 ATP，不會(huì)產(chǎn)生背景發(fā)光。接著，加入專門(mén)的檢測(cè)試劑，將第-一步中激酶反應(yīng)生成的 ADP 重新轉(zhuǎn)化為 ATP。新生成的 ATP 通過(guò)螢光素酶系統(tǒng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，活性信號(hào)強(qiáng)弱和激酶活性成正比^[5]。

由于通量高，成本較低，操作簡(jiǎn)單，Kinase-Glo/ADP-Glo 法幾乎可檢測(cè)任何激酶活性，是大規(guī)模高通量篩選初篩的首-選方法。而相較于 Kinase-Glo 法，ADP-Glo 消除了高濃度初始 ATP 背景的干擾，可以檢測(cè)更微小的活性變化，特別適用于高 ATP 濃度的反應(yīng)條件。

 

4. AlphaScreen/AlphaLISA

AlphaScreen 與 AlphaLISA 技術(shù)的核心在于獨(dú)特的“單線態(tài)氧通道能量轉(zhuǎn)移"體系：供體微珠在 680 nm 激光激發(fā)下產(chǎn)生單線態(tài)氧，這種高能分子可在溶液中擴(kuò)散約 200 nM；只有當(dāng)生物相互作用將供體與受體微珠拉近至此“作用距離"內(nèi)，受體微珠才能接收能量并觸發(fā)內(nèi)部熒光團(tuán)發(fā)光。

AlphaLISA 平臺(tái)是 AlphaScreen 技術(shù)的演變，旨在滿足生物標(biāo)志物檢測(cè)高通量檢測(cè)的要求，主要以即用型試劑盒形式提供。AlphaLISA 類似于 AlphaScreen，不同之處在于磁珠含有銪作為受體熒光。銪發(fā)射在光譜上比 AlphaScreen 測(cè)定中觀察到的更強(qiáng)烈且更清晰。因此，發(fā)射波長(zhǎng)不易受到血紅蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白等化合物的基質(zhì)干擾。與 ELISA 比，AlphaLISA 分析范圍更廣檢測(cè)更加靈敏，且可省去很多洗滌步驟，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間^[6]。

 

圖 4. AlphaScreen 檢測(cè)原理：供體和受體之間的化學(xué)能轉(zhuǎn)移^[6]。

結(jié)合性檢測(cè)不直接測(cè)量酶活性，而是更加關(guān)注化合物與激酶的“親密接觸"。

1. 表面等離子共振 (Surface Plasmon Resonance,SPR)：

表面等離子體共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 是一種高靈敏度的生物傳感技術(shù)，通過(guò)監(jiān)測(cè)生物分子在金屬薄膜表面的相互作用，實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記地提供結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)，廣泛應(yīng)用于分子互作檢測(cè)。

SPR 技術(shù)的核心是利用光在不同介質(zhì)中產(chǎn)生消逝波后與金屬表面的等離子波產(chǎn)生共振，當(dāng)固定在芯片上的配體和流經(jīng)芯片的分析物發(fā)生結(jié)合和解離時(shí)，芯片表面質(zhì)量變化造成共振角發(fā)生變化，傳感圖會(huì)實(shí)時(shí)記錄相互作用下的信號(hào)值，根據(jù)此變化曲線從而得出分子間相互作用的解離常數(shù) (KD)、結(jié)合速率常數(shù) (Ka) 和解離速率常數(shù) (Kd)。通過(guò) SPR 檢測(cè)，可直接獲取激酶與化合物之間的親和力數(shù)據(jù)，對(duì)生化實(shí)驗(yàn)篩選出的激酶抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證。

圖 5. SPR 檢測(cè)原理。

本期，小 M 帶大家了解了激酶活性檢測(cè)到底有哪些方法。當(dāng)然，MCE 也可提供激酶系列化合物庫(kù)，及激酶譜篩選技術(shù)服務(wù)，一站式解決激酶抑制劑活性評(píng)價(jià)需求。有需要的老師快來(lái)私戳小 M 咨詢吧！

[1] Roskoski R Jr. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2025 update. Pharmacol Res. 2025 Jun;216:107723.

[2] Hastie CJ, et al. Assay of protein kinases using radiolabeled ATP: a protocol. Nat Protoc. 2006;1(2):968-71.

[3] Zhang Y, et al. Progress and Prospects in FRET for the Investigation of Protein-Protein Interactions. Biosensors (Basel). 2025 Sep 19;15(9):624.

[4] Koresawa M, et al. Novel detection method for chemiluminescence derived from the Kinase-Glo luminescent kinase assay platform: Advantages over traditional microplate luminometers. MethodsX. 2014 Aug 8;1:96-101.

[5] Tanega C, et al. Comparison of bioluminescent kinase assays using substrate depletion and product formation. Assay Drug Dev Technol. 2009 Dec;7(6):606-14.

[6] Eglen RM, et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Chem Genomics. 2008 Feb 25;1:2-10.