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常見細胞污染鑒別與處理指南 | MCE

閱讀：277 發(fā)布時間：2026-1-12

MCE 抑制劑_2025-12-19_收藏備用! 常見細胞污染鑒別與處理指南

收藏備用! 常見細胞污染鑒別與處理指南

細胞污染是細胞培養(yǎng)技術(shù)中的主要難題。本期咱們就對細胞培養(yǎng)中常見的污染類型與防治策略展開嘮嘮~

Section.01

一、真菌污染

常見的真菌感染包括煙曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、白色念珠菌等。培養(yǎng)液通常清亮或混濁，可通過肉眼或光學顯微鏡觀察到見菌絲或菌鏈狀結(jié)構(gòu)。

特征：

酵母多單個卵球形或球形顆粒。若培養(yǎng)基含 pH 指示劑 (如酚紅)，晚期或嚴重感染時培養(yǎng)基呈堿化 (顏色變紫)^[2]。霉菌則呈鏈球狀或絲狀形態(tài)。

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圖 1. 酵母、念珠菌屬和青霉屬的光學顯微鏡觀察^[2]。

(圖注：左至右依次為典型酵母細胞、白色念珠菌 (Candida sp.) 和青霉菌 (Penicillium sp.) 的形態(tài)學特征，可通過常規(guī)光學顯微鏡進行識別。)

預防及處理：

(1) 日常培養(yǎng)細胞時，可添加一定劑量制霉菌素、兩性霉素、灰黃霉素、克霉唑、氟康唑等抗真菌劑。

(2) 真菌污染極難去除，若細胞珍貴，可先用 PBS 反復洗滌細胞，再用 25 μg/mL 高濃度兩性霉素處理 12 - 24 小時，隨后改用 3 - 5 μg/mL 低濃度兩性霉素繼續(xù)培養(yǎng)，直至傳代后細胞恢復正常。

真菌生長慢，不易及時發(fā)現(xiàn)，一旦察覺往往難以挽救，可丟棄污染細胞 (實驗允許的情況下)，并對培養(yǎng)間、CO₂培養(yǎng)箱、培養(yǎng)器皿及培養(yǎng)液進行消毒滅菌。

Section.02

二、細菌污染

細菌污染是細胞培養(yǎng)中常見且廣泛的污染類型，大多屬于外源性污染。這類污染通常較易檢測與鑒定：初步鑒定可通過肉眼觀察或光學顯微鏡檢查完成，最終則需借助細菌培養(yǎng)及染色等方法進行進一步確認。

特征：

常見的細菌污染包括革蘭氏陰性菌 (如大腸桿菌等) 和革蘭氏陽性菌 (如葡萄球菌、分枝桿菌等)。細菌污染細胞后，多數(shù)情況下細胞培養(yǎng)液會在短時間內(nèi)變黃、出現(xiàn)渾濁，pH 值隨之降低。在倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時細胞表面及周圍會附著大量細菌，受污染的細胞會停止生長并呈現(xiàn)出中毒跡象^[3]。

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圖 2. 細胞培養(yǎng)中分枝桿菌污染的典型形態(tài)^[2]。

預防及處理：

(1) 日常可以培養(yǎng)液中添加雙抗(青/鏈霉素)、西司他丁鈉+亞胺培南等預防細菌污染。

(2) 輕度污染時，先用 PBS 多次清洗細胞稀釋細菌，再用 5 - 10 倍濃度青/鏈霉素等抗生素處理，24 - 48 小時后換為常規(guī)濃度抗生素；重度污染則消殺后丟棄。

細胞培養(yǎng)用抗生素多為預防細菌污染，半數(shù)以上聯(lián)合應用。污染后用抗生素難去除，部分僅抑菌不殺菌，還影響細胞狀態(tài)。所以，防范很重要，關鍵是正確操作、嚴格無菌操作并定期清理消毒培養(yǎng)設施。

Section.03

三、黑膠蟲污染

近些年，國內(nèi)一些實驗室出現(xiàn)一種特殊的細胞污染形式，該污染物在倒置顯微鏡下呈黑點狀，看似細胞碎屑，卻具有一定游動能力。這些黑點狀物質(zhì)通常對宿主細胞沒有明顯影響，只有在細胞復蘇、換液不及時、或傳代密度過低等情況下才會迅速增多并導致細胞死亡，因而有人形象地稱之為“黑膠蟲"^[4]。

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圖 3. 培養(yǎng)體系內(nèi)黑點狀污染物的不同生長狀態(tài)^[4]。

A-C：培養(yǎng)細胞不同生長狀態(tài)下黑點狀物質(zhì)的形態(tài) ×420；D：黑點狀物質(zhì)呈革蘭陰性染色×1 400；E-1：圖 B 中方框部分在不同時間的變化，數(shù)字 1 和 2 標記出兩個游動的黑點狀結(jié)構(gòu) ×1 270；J：細胞死亡后培養(yǎng)瓶內(nèi)充滿黑點狀物質(zhì) ×1 270；K-M：在缺氧和營養(yǎng)匱乏的情況下黑點狀結(jié)構(gòu)之間出現(xiàn)細針狀或同心圓狀結(jié)構(gòu) ×420。

特征：

倒置顯微鏡觀察顯示，“黑顆粒"呈點狀或片狀。透射電鏡觀察顯示，“黑顆粒"呈桿狀，長度為 1300-1600 nm，寬度為 400-500 nm。共聚焦激光掃描顯微鏡原位觀察顯示其具有布朗運動特性^[5]。

預防及處理：

抗生素敏感性試驗表明，“黑顆粒"對氯霉素 (25 mg/L)、紅霉素 (200 mg/L) 和四環(huán)素 (2.5 mg/L) 敏感，但對氨芐青霉素 (50 mg/L)、嘌呤霉素 (2 mg/L)、青霉素-鏈霉素 (100×) 或慶大霉素-兩性霉素 B (100×) 耐藥。結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，在 DMEM 培養(yǎng)基中，氯霉素 (25 mg/L)、紅霉素 (200 mg/L) 或四環(huán)素 (2.5 mg/L) 均能抑制“黑顆粒"的增殖，且對細胞增殖的抑制作用較弱^[5]。

Section.04

四、交叉污染

交叉污染常源于細胞建株與傳代時兩種或以上細胞的混合污染。細胞培養(yǎng)中，不同細胞理化特性和培養(yǎng)操作要求不同，若在同一無菌環(huán)境操作，試驗材料易引發(fā)細胞交叉污染，改變細胞形態(tài)、生物學活性及特性。

目前可用于檢測交叉污染和細胞錯誤鑒定的方法包括^[6]:

表 2. 用于鑒定細胞系的常用方法^[6]。

Section.05

五、支原體污染

支原體也是細胞培養(yǎng)過程中常見的污染源，其個體微小 (0.3～0. 8 μm)，可穿過 0.45 μm 孔徑濾膜,且對大多數(shù)抗生素不敏感,因此極難防治^[7]。

特征：

支原體具有隱蔽性，不引起培養(yǎng)基渾濁或細胞明顯形態(tài)變化，常規(guī)顯微鏡無法發(fā)現(xiàn)^[1]。

檢測方法：

可通過熒光染料 (DAPI 或 Hoechst 33342) 進行特異性 DNA 染色、ELISA 檢測、PCR 檢測細菌 16S rRNA，以及復雜的傅里葉變換紅外 (FITR) 顯微光譜等多種方式進行檢測^[1]。

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圖 4. 支原體的結(jié)構(gòu)及檢測^[1]。

(A) 支原體為最小的自我復制細菌，無細胞壁，由脂蛋白膜、核糖體及環(huán)狀雙鏈 DNA 組成。(B)污染的大鼠細胞單層經(jīng) DAPI 染色，在熒光顯微鏡下 (340/380 nm激發(fā)，400×放大倍率) 可見細胞核外微小亮點 (箭頭)，為支原體的典型特征。(C)PCR 檢測結(jié)果：內(nèi)部對照 191 bp 產(chǎn)物確認 PCR 正常，265–278 bp 產(chǎn)物表明支原體污染。

預防及處理：

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當然，生物污染還包括病毒污染。細胞培養(yǎng)中的病毒污染通常源于動物血清或管理不規(guī)范的動物細胞庫，以外源性污染為主，也存在內(nèi)源性污染 (如細胞株建立過程中產(chǎn)生的污染)。多數(shù)外源性和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞后，被感染細胞不會出現(xiàn)形態(tài)變化或細胞病變，可通過紅細胞吸附試驗、免疫熒光抗體技術(shù)及電子顯微鏡等方法進行檢測^[3]。

此外，還存在另一類細胞培養(yǎng)污染物——化學污染物，如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)，包括內(nèi)毒素、增塑劑和洗滌劑等。

不過，隨著即用型輻照塑料培養(yǎng)容器和移液管以及市售無菌試劑 (如培養(yǎng)基、緩沖液和生長補充劑) 的出現(xiàn)，此類化學試劑的污染現(xiàn)已大大減少^[2]。

當然，大家還是要有防污染意識，盡量從根源避免污染的發(fā)生！

Section.06

小結(jié)

在細胞培養(yǎng)中，造成細胞污染的原因各異，控制細胞污染的舉措多樣。本期為大家介紹了細胞培養(yǎng)污染的種類以及防治舉措。相信大家只要注意操作環(huán)節(jié),加強無菌意識，就能有效地減少和控制污染、降低損失~

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今天有組會

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師兄怎么復現(xiàn)啊

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怎么又要去實驗室，有誰在啊

好的

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參考文獻：

[1] Weiskirchen S, et al. A Beginner's Guide to Cell Culture: Practical Advice for Preventing Needless Problems. Cells. 2023 Feb 21;12(5):682.

[2] Nims RW, Price PJ. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017 Dec;53(10):872-879.

[3] 安芳蘭,等.大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中污染的類型及控制策略探討[J].甘肅畜牧獸醫(yī), 2016, 46(19):4.

[4] 譚百宏，等.細胞培養(yǎng)中黑點狀污染物的種類及對治方法。安徽醫(yī)科大學學報 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Jan;58(1).

[5] 周怡婷,等.細胞培養(yǎng)中“黑膠蟲"污染的檢測及防治[J].生物化學與生物物理進展,2020,47(01):61-70.

[6] Capes-Davis A, et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. Int J Cancer. 2010 Jul 1;127(1):1-8.

[7] 曾今誠,等，細胞培養(yǎng)及常見污染防治技術(shù)進展.國際檢驗醫(yī)學雜志2012年10月第33卷第20期 IntJLabMed，October2012，Vo1．33，No．20.

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