『原理』：經熒光標記的細胞在鞘液包裹下形成單細胞流，依次通過激光檢測區(qū)。激光照射細胞后會產生兩種關鍵信號：散射光 (反映細胞大小和內部復雜度) 和熒光 (揭示特定分子標記)。這些光信號被精密的光學系統(tǒng)接收并轉換為電信號，經計算機處理形成直觀圖譜。——從而對異質性細胞群體進行細分與定量統(tǒng)計。

圖 1.流式細胞術原理圖^[1]。

此外，具備分選功能的儀器還能通過使液滴帶電的方式，將特定目標細胞精準分離出來，從而實現高速、高純度的細胞分選，廣泛應用于免疫學、腫瘤學等研究領域。

Section.02

對照組設計

對照組的設置是實驗的基石，其根本目的是確保實驗結果的特異性、準確性和可解釋性。

陰性對照

• Blank Control：空白對照/未染色對照，不加任何抗體的細胞。用來確定陰性細胞群的物理特性 (大小、顆粒度)，作為調節(jié)電壓的初始參考，并觀察細胞的自發(fā)熒光背景。

• Isotype Control：同型對照，使用與一抗同種屬、同亞型、同標記的非特異性抗體，用于排除抗體的非特異性結合。

• Positive/Negative Control：陽性/陰性生物學對照，已知表達/不表達目標抗原的細胞樣本。

• FMO Control：Fluorescence-Minus-One Control, 熒光減一對照。在一個多色染色 Panel 中，去掉其中一種抗體，其余抗體照常加入。在扣除一個顏色后，我們可以直觀看到其他熒光基團在扣除顏色的通道上的溢漏，從而能更準確地設置圈門位置。

• Single-Stained Control：單陽管/單染對照，每管只加一種熒光標記的抗體。這是進行熒光補償調節(jié)的關鍵！另外也可以協(xié)同調電壓，防止陽性信號超出接收范圍。

  
  

Section.03

實驗流程

『全血/PMBC』

1. 紅細胞裂解：使用紅細胞裂解液，在染色后或染色前裂解紅細胞。注意裂解后需用 PBS 充分洗滌。

2. 密度梯度離心 (如 Ficoll)：用于分離 PBMC，可獲得高純度的淋巴細胞。

『細胞系』

1. 貼壁細胞系：用胰酶 (含 EDTA) 消化細胞。在顯微鏡下觀察，當細胞變圓、間隙變大時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使其脫離培養(yǎng)皿表面，形成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管，300-500g 離心 5 min，棄上清，PBS 重懸洗滌。

2. 懸浮細胞系：直接收集細胞培養(yǎng)液，300-500g 離心 5 min，棄上清，PBS 重懸洗滌。

『組織樣本』

1. 機械分離：在含血清的培養(yǎng)基或 PBS 中，用注射器活塞、研磨棒或 70μm 細胞篩網研磨。

2. 酶學消化：對于致密組織 (如實體瘤)，使用膠原酶、DNA 酶等混合酶液在 37°C 下消化 15-45 min，以解離細胞。注意處理后必須過 70μm 濾網，以去除細胞團塊和碎片。

『細胞計數』

使用血球計數板或自動細胞計數儀進行計數。

1. 取少量細胞懸液，與臺盼藍或自動細胞計數儀專用染料混合。

2. 進行計數，并計算細胞濃度和活力。活力應高于 90%。

『原理』：固定步驟是為了保留細胞內蛋白質的結構。 通透步驟會破壞細胞膜，使抗體進入細胞并對細胞內靶點進行染色。對細胞內靶點進行染色時，須進行額外的固定和通透步驟。

『固定』

『操作』：

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛冰上固定細胞 15 ~ 20 min；

2. 洗滌：減速離心細胞 (200 x g, 5 min, 4°C) 得到沉淀，棄去上清液，并在洗滌緩沖液中重懸沉淀。清洗 3 次，以去除殘留的固定液。

『注意』：

① 針對不同的抗原，需要優(yōu)化固定步驟。

② 有些表位對甲醇非常敏感，因此如果檢測出現任何問題，可以嘗試使用丙酮。

③ 洗滌次數、離心時間和速度可能需要優(yōu)化。

表1. 常用固定試劑

『透化』

『操作』：

1. 一邊溫和渦旋細胞，一邊向細胞中緩慢添加預冷的甲醇，使細胞透化。

『注意』：

① 如果已使用有機溶劑 (甲醇、丙酮) 作固定劑，則不需要該步驟，因為丙酮也可以通透細胞。

② 洗滌劑取決于蛋白及其定位。Triton 或 NP-40 等強效洗滌劑還會溶解部分核膜，因此適用于核抗原染色。而吐溫 20 或皂素等溫和洗滌劑，能夠在不溶解質膜的同時使抗體穿過孔，因此適合細胞質中的抗原，或質膜的細胞質面和可溶性核抗原。

該步驟用于減少非特異性結合，從而降低背景信號，提高信噪比和數據質量。可分為 Fc 受體封閉劑和非特異性蛋白封閉劑兩類。

『操作』：

1. 減速離心細胞 (200 x g，5 min，4°C) 得到沉淀，棄去上清液。

2. 加入封閉緩沖液，輕輕吹打混勻重懸沉淀。4'℃ 避光孵育細胞 30-60 min。

該步驟用使抗體充分與目的蛋白抗原結合，決定了熒光信號的位置和特異性，進而影響實驗結果的準確性和可靠性。

該步驟可選擇 (i)直接檢測：一抗直接與熒光基團偶聯(lián)。(ii) 間接檢測：使用合適的熒光標記二抗檢測一抗。這兩種方法各有優(yōu)點和缺點。

圖 4. 直接法和間接法示意圖。

『操作』：(以直接檢測為例)

1. 孵育：冰上或 4°C 避光孵育 20-30 min。

2. 洗滌：加入過量洗滌緩沖液，離心 (300-400g, 5 min)，棄上清。重復 1-2 次以去除未結合的抗體。

抗體孵育后，將細胞充分重懸于適量 PBS 或鞘液中進行上機檢測。